Summary
单侧后肢缺血诱导的外科手术，激光多普勒血流灌注显像缺血确认证明。
Abstract
在美国，周围动脉疾病（PAD）影响约10万个人，是全世界也普遍存在。为缓解症状的药物治疗是有限的。手术或血管内介入一些个人是有用的，但长期的结果往往令人失望。因此，有需要开发新的疗法来治疗PAD。小鼠后肢缺血准备的PAD的典范，是用于测试新疗法。当相比，其他车型的组织缺血，如冠状动脉或脑动脉结扎，结扎股动脉提供了一个简单的模型缺血组织。这个模型的其他优点是易于访问股动脉和低死亡率。
在这段视频中，我们展示了单方面hindimb缺血小鼠模型的方法。将描述创建和评估模型的具体材料和程序，包括肢体灌注的激光多普勒成像技术评估。此协议也可以用于移植和非侵入性的细胞，这是由黄等证明。的跟踪。
Protocol
1。单侧肢体缺血诱导
- 此操作所需的手术工具包括：细尖头镊子，尖头镊子，弹簧剪刀，手术剪，持针器，并牵开。我们做我们自己的拉钩使用回形针，因为它是比市售拉钩小。术前高压灭菌器或热珠灭菌消毒这些工具。一个烧灼的工具和消毒罚款指出棉签将也需要这种手术。建议在操作过程中所需的技巧重新消毒的工具。
- 当工具都准备好，放入含有1-3％，在100％的氧气，在流速为1L/min时异氟醚麻醉诱导室的鼠标。
- 留在鼠标感应室，直到它是对外界刺激的反应迟钝。然后从动物感应室。建议从包装盒中冲洗麻醉前，打开盖子，以减少操作人员暴露，以异氟醚。
- 然后仰卧位放置在上手术台前，动物和它连接到一个异氟醚的连续流。使用电动剃须刀，头发从后肢删除。应用脱毛膏彻底清除头发。
- 鼠标放置在褶上手术台的加热垫仰卧位，并把它连接到一个异氟醚的连续流。一块磁带扩展和安全的后肢。一旦后肢是安全的，请用三个交替优碘和酒精擦洗皮肤。对于手术过程的其余部分，使用10X或20X放大倍率一个解剖镜下获得的后肢地区扩大。
- 用细镊子和手术剪，使皮肤切口，约1厘米长，从膝盖向大腿内侧。
- 使用磷酸盐缓冲液（PBS）的湿细尖的棉签，轻轻地刷了皮下脂肪组织周围的大腿肌肉。
- 接下来，应用烧灼横向切割，并通过皮下脂肪组织的解剖，揭示了潜在的股动脉。
- 用牵开器打开伤口，并获得更好的下肢血管。
- 透过膜股鞘罚款钳和罚款指出棉签，轻轻捅破，暴露的神经血管束。
- 然后，使用一个精细镊子和棉签清洁，解剖和分离股动脉，股静脉和神经在腹股沟附近的近端位置。剥离后，通过7-0丝线缝合下方的股动脉近端钢绞线。近端闭塞的股动脉，使用双海里。近端血管放置在伤口尽可能的配合，以假为第二领带的长度和干预段将被切断。
- 从股静脉在远端位置靠近膝盖的分离股动脉。传递一个7-0下方的股动脉，腘动脉近端远端缝合链。闭塞的使用双海里的船只。
- 闭塞远端与近端节的第一双海里的第二套的股动脉。第二套这种缝合线将用于攥在交易过程中的动脉。
- 同样，扣人心弦的目的，闭塞近端与远端节的第一双海里的第二套的股动脉。
- 断面的股动脉之间用细尖的棉签和一双弹簧剪刀的远端和近端节段。使用小心不要刺破股静脉壁。
- 取出拉钩，用5-0薇乔缝线关闭切口。这些缝线不需要在以后的时间被删除，因为它们溶于自己。
- 一旦关闭切口，放置在一个搭着回收笼在加热垫的顶部的动物和不断监视，直到清醒。
- 动物后1小时恢复，进行激光多普勒血流灌注的步骤，以确认缺血诱导。
2。激光多普勒血流灌注
- 要开始的激光多普勒血流灌注一步，放入含有1-3％，在100％的氧气，在流速为1L/min时异氟醚麻醉诱导室的鼠标。
- 留在鼠标感应室，直到它是对外界刺激的反应迟钝。然后从动物感应室。建议从包装盒中冲洗麻醉前，打开盖子，以减少操作人员暴露，以异氟醚。
- 将连接到异氟醚的连续流前手术台动物。然后取出使用电动剃须刀，其次是必要的头发脱毛膏后肢头发。
- 取出后的头发，放置在37℃加热5分钟下连续流异氟醚表面的动物。监控核心温度，以确保euthermia，随着温度的变化会显着影响灌注。
- 5分钟后，动物在无反射光吸收的表面，如绿色的布，连接到一个异氟醚的连续流动，仰卧位。扩展的后肢。
- 接下来，打开激光多普勒成像仪和数据采集软件和初始化软件。指定大小的观点和解决的领域。这是最好的动物之间保持一致的观点和像素密度领域，以便使将来的分析更容易。
- 打开一个新的文件。按开始着手获取的图像数据。一般来说，热像仪自动检测鼠标的距离，但如果出现提示，指定动物的距离的成像。激光将显示视野的边界，然后开始采集数据。
- 收购完成后，图像将开始显示，灌注到腿的血液水平的指标的颜色范围。颜色可以设置到一个特定的灌注范围，以便更好地与动物之间进行比较的数据。
- 当数据采集完成后，保存文件。
- 然后返回的回收笼的动物和动物连续监测，直到清醒。
- 的数据进行分析，利用分析软件的门槛调整，减去任何背景噪音。 0.2阈值通常是一个合理的值。选择2个区域的利益，或投资回报，其范围包括每个后肢面积。可用于各种地标，规范四肢和动物之间的投资回报率。然后确定的投资回报率平均灌注性和多变性。灌注之间的差异和肢体缺血和控制肢体血流比值，然后可以很容易地确定。
- 重复此过程可遵循后肢灌注的变化，随着时间的推移。在所需的时间点，动物可以安乐死评估组织的功能和灌注图像数据相比。
3。代表性的成果：
后肢血管的解剖结构显示在图 1 2。后肢股动脉explantation后的一个代表图如图2所示。为了确认后肢缺血诱导，激光多普勒血流灌注图像分析表明以肢体缺血的血流量急剧减少，在控制肢体比较，如图3所示。
图1。后肢血管解剖。星号表示，为肢体缺血诱导结扎的位置。
图2显示后肢的解剖结构去除后，股动脉的近端和远端站点的股动脉结扎后的代表图。
图3激光多普勒图像显示缺血诱导的左后肢（箭头指示）之前和之后的血流量。
Discussion
有一些变异来源的考虑，同时规划和执行后肢缺血模型。首先，缺血的水平可能会有所不同，根据结扎偏科的位置。因此，动物模型的一致性，应接受动脉结扎的同一水平。缺血性恢复的变化的另一个来源是动物的年龄有关，与年轻的动物，具有更快和更完整的回收率比年长的动物（8-10个月大的）（6-8周龄），作为评估血流动力学（即激光多普勒血流灌注）或功能（如跑步机测试）的措施。其中之一是评估血管生成剂的研究，它可能是最好使用旧的动物，因为群体之间有较大的差异，可能与干预治疗观察。相反，研究，其中之一是评估一个抗血管生成的因素，它可能是可取的使用年轻的动物，最大限度地发挥规模效应3。
如果正确执行，应该有最小的并发症如出血，感染，或死亡率等。如果出血发生意外中断，通过股静脉或其他船只，适度的压力，用无菌棉放倒撒施或纱布，应适用于出血部位，直到出血停止。动物感染的迹象，应与抗感染药物治疗。动物表现出显着性坏疽可能需要beeuthanized。这种并发症是较常见的老年动物，并在某些菌株，如BALB C小鼠4。此外，后肢缺血模型可能会导致轻度至中度疼痛。因此，止痛药，如丁丙诺啡或卡洛芬应管理作为疼痛治疗的需要，根据IACUC的建议。
总之，我们已经证明了一个简单和可重复性的方法研究在小鼠后肢缺血模型的PAD。后肢缺血模型，用激光多普勒成像分析是一个优秀的系统，为研究血管病症和评估治疗候选人。
Acknowledgments
作者感谢安德烈阿克斯特尔，伊藤聪，MD，杰夫Velotta，医学博士，格兰特霍伊特，罗伯特C ·罗宾斯博士，金钰，医学博士，添多伊尔，博士和斯坦福大学的小动物成像核心技术援助。作者还感谢支持兽医设备AM比克福德公司。支持这项研究是由美国国立卫生研究院的研究补助金（R01 HL - 75774，R01，R21 HL085743，CA098303 1K12 HL087746），加利福尼亚州烟草相关疾病的研究计划的加州大学（15IT - 0257和1514RT - 0169） ，并为加州再生医学（RS1 - 00183）研究所。新罕布什尔州是支持由美国心脏协会的奖学金。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
