Summary
ההליך הכירורגי לזירוז של איסכמיה hindlimb החד צדדית באה לידי ביטוי, עם אישור של איסכמיה על ידי הדמיה זלוף דופלר לייזר.
Abstract
בארצות הברית, מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה על כ -10 מיליון אנשים, והיא נפוצה גם ברחבי העולם. טיפולים רפואיים להקלה סימפטומטית מוגבלים. התערבויות כירורגיות או endovascular שימושיים עבור אנשים מסוימים, אבל לטווח ארוך התוצאות הן לעתים קרובות מאכזב. כתוצאה מכך, יש צורך בפיתוח טיפולים חדשים לטיפול PAD. הכנת Murine איסכמיה hindlimb הוא מודל של PAD, והוא שימושי לבדיקה טיפולים חדשים. כאשר לעומת דגמים אחרים של איסכמיה רקמות כגון קשירת עורקים כליליים או מוחין, קשירת עורק הירך מספק מודל פשוט יותר של רקמה איסכמית. יתרונות אחרים של מודל זה הם וקלות הגישה עורק הירך לבין שיעור תמותה נמוך.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המתודולוגיה של המודל Murine של איסכמיה hindimb חד צדדית. חומרים ותהליכים ספציפיים ליצירת מודל הערכת יתוארו, כולל הערכה של זלוף איבר על ידי לייזר דופלר הדמיה. פרוטוקול זה יכול גם להיות מנוצל להשתלה ולא פולשנית מעקב של תאים, אשר באה לידי ביטוי הואנג et al. 1.
Protocol
1. אינדוקציה של איסכמיה Hindlimb חד צדדית
- כלי הניתוח הדרוש לפעולה זו כוללים: מלקחיים הצביע בסדר, הצביע מלקחיים, מספריים באביב, מספריים כירורגיות, מחזיק מחט, והוא מפשק. אנחנו עושים מפשק שלנו באמצעות מהדק כי הוא קטן יותר מאשר retractors זמינים מסחרית. לעקר בכלים אלה לפני הניתוח על ידי החיטוי או מעקר חם חרוז. כלי כויה וסטרילי ספוגיות כותנה דק הצביע יהיה גם צורך בניתוח זה. מומלץ כי את הכלים להיות מעוקרים מחדש בקצות כנדרש במהלך ההליך.
- כאשר הכלים מוכנים, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min.
- השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. מומלץ לשטוף את ההרדמה מתיבת לפני פתיחת המכסה, כדי להקטין את החשיפה למפעיל isoflurane.
- אז במקום חיה במצב פרקדן על השולחן מראש ההפעלה ולחבר אותו זרם מתמשך של isoflurane. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, להסיר את השיער מן hindlimb. החל קרם להסרת שיער ביסודיות להסיר שיער.
- מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על משטח לוהט עטוף על שולחן הניתוחים, ולחבר אותו זרם מתמשך של isoflurane. הרחב ולהבטיח את hindlimb עם חתיכת סרט. לאחר hindlimb הוא מאובטח, לנגב את העור עם שלושה עלובי לסירוגין בבטאדין ואלכוהול. במשך שארית ההליך הכירורגי, במיקרוסקופ לנתיחה בבית 10X או 20X הגדלה לקבל תצוגה מוגדלת של האזור hindlimb.
- בעזרת מלקחיים בסדר ומספריים כירורגית, לעשות חתך של העור, כ 1 ס"מ, מהברך כלפי הירך המדיאלי.
- שימוש שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), לחלח בסדר צמר גפן הצביע, בעדינות לסלק רקמות שומן תת עורי המקיפים את שריר הירך.
- הבא, להחיל את כויה רוחבי כדי לחרות ו לנתח באמצעות רקמת שומן תת עורי כדי לחשוף את עורק הירך הבסיסית.
- השתמש מפשק לפתוח את הפצע כדי לקבל תצוגה טובה יותר של כלי הדם בגפיים התחתונות.
- בעזרת מלקחיים בסדר ספוגית כותנה דק ומחודד, בעדינות לחדור דרך מעטה הירך קרומי לחשוף את צרור neurovascular.
- לאחר מכן, באמצעות מערכת נקייה של מלקחיים בסדר צמר גפן, לבתר להפריד את עורק הירך מהעורק עצב הירך ואת במיקום פרוקסימלי ליד המפשעה. לאחר דיסקציה, לעבור קווצת תפר 7-0 משי מתחת סוף הפרוקסימלי של עורק הירך. לחסום את עורק הירך הפרוקסימלית באמצעות קשרים כפולים. מניחים את העניבה על הספינה כמו הפרוקסימלי של הפצע ככל האפשר כדי להשאיר אורך לקשור את השני קטע להתערב כי יהיה transected.
- הפרד את עורק הירך מעורק הירך במיקום דיסטלי קרוב לברך. Pass קווצת תפר 7-0 מתחת בסוף הדיסטלי של העורק הפמורלי בקרבה העורק popliteal. לחסום את כלי השיט באמצעות קשרים כפולים.
- לחסום את עורק הירך הדיסטלי עם קבוצה שנייה של קשרים כפולים הפרוקסימלי רק כדי להגדיר את הראשון של קשרים. סט שני של התפרים ישמש מרתק העורק במהלך ההליך העסקה.
- באופן דומה, למטרות מרתק, לחסום את עורק הירך הפרוקסימלי עם קבוצה שנייה של קשרים כפולים דיסטלי רק כדי להגדיר את הראשון של קשרים.
- Transect קטע של עורק הירך בין קשרים דיסטלי וסמוך ספוגית כותנה דק מחודד מספריים האביב. היזהר לא לנקב את קיר עורק הירך.
- הסר את מפשק ולסגור את החתך באמצעות תפרים Vicryl 5-0. תפרים אלה אינם צריכים להסיר במועד מאוחר יותר, כפי שהם נמסים מעצמם.
- לאחר חתך סגור, במקום חיה על גבי משטח לוהט עטוף בכלוב התאוששות לפקח ברציפות עד ערה.
- לאחר חיה התאוששה במשך שעה 1, להמשיך את הצעד דופלר לייזר זלוף דם כדי לאשר את הגיוס איסכמיה.
2. לייזר דופלר זלוף דם
- כדי להתחיל את הצעד דופלר לייזר זלוף, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min.
- השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. מומלץ לשטוף את ההרדמה מתיבת לפני פתיחת המכסה, כדי להקטין את החשיפה למפעיל isoflurane.
- מניחים את חיה על השולחן מראש ההפעלה מחובר זרימה רציפה של isoflurane. ואז להסיר את השיער מן hindlimb באמצעות מכונת גילוח חשמלית ואחריו קרם להסרת שיער לפי הצורך.
- לאחר הסרת השיער,במקום חיה על משטח מחומם 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות תחת זרימה רציפה של isoflurane. צג הטמפרטורה הליבה כדי להבטיח euthermia, כמו שינויי טמפרטורה יהיה להשפיע במידה ניכרת זלוף.
- אחרי 5 דקות, במקום חיה במצב פרקדן על משטח אור קליטת שאינם משקפים כגון בד בצבע ירוק, קשור זרימה רציפה של isoflurane. הרחבת hindlimbs.
- לאחר מכן, להפעיל את הלייזר דופלר imager ואת תוכנת הרכישה לאתחל את התוכנה. ציין את גודל שדה הראייה ואת הפתרון. עדיף לשמור את שדה הראיה וצפיפות פיקסל עקבי בין בעלי חיים על מנת להפוך בעתיד ניתוח קל יותר.
- פתיחת קובץ חדש. לחצו על התחל כדי להתחיל לרכוש את נתוני התמונה. באופן כללי, imager מזהה אוטומטית את המרחק של העכבר, אבל אם תתבקש לעשות זאת, ציין את המרחק של החיה כדי imager. הלייזר יראה את הגבולות של שדה הראייה ולאחר מכן להתחיל לרכוש נתונים.
- לאחר הרכישה תושלם, התמונה תתחיל להופיע מגוון של צבעים המעידים על רמת זלוף דם לרגליים. צבעים ניתן להגדיר מגוון זלוף ספציפיים יותר להשוות נתונים בין בעלי חיים.
- כאשר תושלם רכישת נתונים, שמור את הקובץ.
- ואז להחזיר את החיה לכלוב התאוששות ולנטר את חיה ברציפות עד ערה.
- כדי לנתח את הנתונים, השתמש התאמה לסף בתוכנה ניתוח לחסר כל רעשי רקע. סף של 0.2 בדרך כלל ערך סביר. בחר 2 אזורים של עניין, או ROIs, כי כיסוי כל שטח hindlimb. מגוון של ציוני דרך ניתן להשתמש כדי לתקנן את ההחזר על ההשקעה בין איברים חיים. ואז לקבוע את השתנות אומר זלוף וב ההחזר על ההשקעה. ההבדל זלוף זלוף יחס בין האיבר איסכמית איבר לשלוט אז יכול להיות נחוש בקלות.
- הליך זה ניתן לחזור לעקוב אחרי השינויים זלוף hindlimb לאורך זמן. בשלב הזמן הרצוי, בעל החיים יכול להיות מורדמים לצורך הערכה של תפקוד רקמות לעומת נתוני התמונה זלוף.
3. נציג תוצאות:
האנטומיה של vasculature hindlimb מוצג באיור 1 2. תרשים נציג hindlimb לאחר explantation עורק הירך מוצג באיור 2. כדי לאשר את הגיוס של איסכמיה של hindlimb, ניתוח לייזר דופלר תמונה זלוף מדגים הפחתה דרמטית את זרימת הדם אל איבר איסכמי, בהשוואה איבר הבקרה, כפי שמוצג באיור 3.
באיור 1. אנטומיה של vasculature hindlimb. כוכביות לציין את מיקומם של קשירת לזירוז של איסכמיה hindlimb.
איור 2. דיאגרמה נציג מראה את האנטומיה של hindlimb לאחר קשירת של העורק הפמורלי באתרי הפרוקסימלית ומ דיסטלי לאחר ההסרה של עורק הירך.
3. איור לייזר דופלר תמונות מראה זרימת הדם לפני ואחרי הגיוס של איסכמיה כדי hindlimb שמאל (מסומן בחץ).
Discussion
ישנם כמה מקורות של השתנות לשקול בעת תכנון וביצוע מודלים איסכמיה hindlimb. ראשית, ברמה של איסכמיה עשויים להשתנות בהתאם למיקום של קשירת ביחס לזה של ענפים בצד. לכן, עבור עקביות של המודל, החיות צריכים לעבור את אותה רמה של קשירת העורקים. מקור נוסף של השתנות התאוששות איסכמי קשורה לגיל של החיות, עם בעלי חיים צעירים (6-8 שבועות) לאחר שיעורי החלמה מהירה ומלאה יותר מאשר בעלי חיים מבוגרים יותר (80-10 חודשים), כפי שנבחנו על ידי hemodynamic (כלומר זלוף לייזר דופלר) או פונקציונלי (כלומר בדיקה הליכון) מודד. עבור מחקרים בהם אחד הוא הערכת סוכן angiogenic, זה עשוי להיות עדיף להשתמש בבעלי חיים מבוגרים, כי הבדל גדול בין הקבוצות אפשר לראות עם התערבות טיפולית. לעומת זאת, עבור מחקרים בהם אחד להערכת גורם אנטי angiogenic, זה עשוי להיות עדיף להשתמש בבעלי חיים צעירים על מנת למקסם את גודל ההשפעה 3.
אם מבוצע כהלכה, לא צריך להיות מינימלי לסיבוכים כגון דימום, זיהום, או תמותה. אם הדימום מתרחש על ידי הפרעה מקרית של עורק הירך או כלי אחר, לחץ מתון עם צמר גפן סטרילי היטה המוליך או גזה יש להחיל לאתר של דימום עד שהדימום ייפסק. בעלי חיים מראה סימנים של זיהום יש לטפל עם אנטי זיהומיות סוכנים. בעלי חיים מציג נמק משמעותי ייתכן שיהיה צורך beeuthanized. סיבוך זה שכיח יותר אצל בעלי חיים מבוגרים, כמה זנים, כגון עכברים BALB ג 4. בנוסף, מודל איסכמיה hindlimb עלול לגרום לכאב קל עד מתון. לכן, משככי כאבים כגון עצירות או carprofen צריכה להינתן לפי הצורך לטיפול בכאב, על פי המלצות IACUC.
לסיכום, אנו הדגימו שיטה פשוטה לשחזור ללימוד PAD במודל של איסכמיה Murine hindlimb. המודל איסכמיה hindlimb עם ניתוח לייזר דופלר הדמיה היא מערכת מצוינת ללמוד פתולוגיות כלי הדם להערכת מועמדים טיפולית.
Acknowledgments
המחברים מודים אנדריאה Axtell, סטושי Itoh, MD, ג'ף Velotta, MD, גרנט הויט, רוברט ג רובינס, MD, יו ג'ין, MD, טים דויל, PhD, והדמיה הקטן סטנפורד בעלי חיים Core לקבלת סיוע טכני. המחברים גם להודות AM ביקפורדס, Inc התמיכה של ציוד וטרינרי. מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL-75774 R01, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), טבק קשורות קליפורניה מחלות תוכנית המחקר של אוניברסיטת קליפורניה (15IT-0257 ו-1514RT 0169) , ומכון קליפורניה עבור הרגנרציה לרפואה (RS1-00183). NH נתמך על ידי מענק של איגוד הלב האמריקני.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
