Summary
La procedura chirurgica per l'induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterale è dimostrato, con la conferma di ischemia da imaging laser Doppler perfusione.
Abstract
Negli Stati Uniti, malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce circa 10 milioni di persone, ed è anche diffusa in tutto il mondo. Terapie mediche per alleviare la sintomatologia sono limitati. Interventi chirurgici o endovascolari sono utili per alcuni individui, ma a lungo termine i risultati sono spesso deludenti. Di conseguenza, vi è la necessità per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di PAD. Il murini preparazione ischemia degli arti posteriori è un modello di PAD, ed è utile per testare nuove terapie. Rispetto ad altri modelli di ischemia tissutale, come la legatura dell'arteria coronarica o cerebrale, la legatura dell'arteria femorale prevede un modello più semplice del tessuto ischemico. Altri vantaggi di questo modello sono la facilità di accesso all'arteria femorale e tasso di mortalità bassa.
In questo video, dimostriamo la metodologia per il modello murino di ischemia hindimb unilaterale. I materiali e procedure specifiche per la creazione e la valutazione del modello sarà descritto, compresa la valutazione della perfusione con laser Doppler. Questo protocollo può essere utilizzato anche per il trapianto e non invasivo il monitoraggio delle cellule, che è dimostrato da Huang et al. 1.
Protocol
1. Induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterali
- Gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione sono: belle pinze a punta, pinze a punta, forbici primavera, forbici chirurgiche, porta aghi, e divaricatore. Noi facciamo il nostro retrattore usando una graffetta, perché è più piccolo di divaricatori disponibili in commercio. Sterilizzare questi strumenti prima di un intervento da parte di un autoclave o di un hot-tallone sterilizzatore. Uno strumento di cauterizzazione e sterile, tamponi di cotone fatto bene sarà anche necessaria per questo tipo di chirurgia. Si raccomanda che gli strumenti essere ri-sterilizzati alle punte, se necessario durante la procedura.
- Quando gli strumenti sono pronti, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min.
- Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l'anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l'esposizione dell'operatore isoflurano.
- Poi posto l'animale in posizione supina sul tavolo pre-operativi e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Utilizzando un rasoio elettrico, togliere i capelli dalla arti posteriori. Applicare la crema di rimozione dei capelli per rimuovere completamente i capelli.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un pad riscaldato drappeggiato sul tavolo operatorio, e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Estendere e proteggere le arti posteriori con un pezzo di nastro adesivo. Una volta che l'arti posteriori è sicuro, pulire la pelle con tre scrub alternati Betadine e alcol. Per il resto della procedura chirurgica, l'uso di un microscopio a dissezione 10X o 20X di ingrandimento di ottenere una visione allargata della regione degli arti posteriori.
- Utilizzando una pinza sottile e forbici chirurgiche, fare un'incisione della pelle, circa 1 cm di lunghezza, dal ginocchio verso la coscia mediale.
- Utilizzando tampone fosfato (PBS)-tamponi di cotone inumiditi multa a punta, delicatamente spazzare via tessuto adiposo sottocutaneo che circondano il muscolo della coscia.
- Successivamente, applicare il cauterio trasversalmente a incidere e sezionare attraverso il tessuto grasso sottocutaneo per rivelare l'arteria femorale sottostante.
- Utilizzare un divaricatore per aprire la ferita e per ottenere una migliore visione del sistema vascolare delle estremità inferiori.
- Utilizzando una pinza sottile e un batuffolo di cotone sottile a punta, delicatamente trafiggerà la guaina membranosa femorale per esporre il fascio neurovascolare.
- Poi, utilizzando una serie pulita di una pinza sottile e tampone di cotone, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e al nervo posizione prossimale vicino all'inguine. Dopo la dissezione, passare un filo di sutura di seta sotto 7-0 alla fine prossimale dell'arteria femorale. Occludere l'arteria femorale prossimale con doppi nodi. Posizionare la cravatta sulla nave come prossimale nella ferita il più possibile in modo da lasciare lunghezza per il pareggio secondo e un segmento di intervento che verranno recisi.
- Separare l'arteria femorale dalla vena femorale nella posizione distale vicino al ginocchio. Passare un filo di sutura sotto 7-0 alla fine distale dell'arteria femorale prossimale all'arteria poplitea. Occludere il vaso con doppi nodi.
- Occludere l'arteria femorale distale con una seconda serie di doppi nodi appena prossimale alla prima serie di nodi. Questa seconda serie di punti di sutura saranno utilizzati per la presa l'arteria durante la procedura di transazione.
- Allo stesso modo, per scopi di presa, occludere l'arteria femorale prossimale con una seconda serie di doppi nodi appena distale rispetto alla prima serie di nodi.
- Transetto il segmento di arteria femorale tra i nodi distali e prossimali con un tampone di cotone sottile a punta e un paio di forbici primavera. Fare attenzione a non forare la parete della vena femorale.
- Rimuovere il riavvolgitore e chiudere l'incisione con 5-0 punti di sutura Vicryl. Questi punti di sutura non devono essere rimosse in un secondo momento, come si dissolvono da soli.
- Una volta che l'incisione è chiuso, l'animale posto in cima ad un pad riscaldato drappeggiata nella gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando sveglio.
- Dopo animale ha recuperato per 1 ora, procedere con il passaggio del sangue perfusione laser Doppler per confermare l'induzione di ischemia.
2. Laser Doppler sangue perfusione
- Per iniziare la perfusione laser Doppler passo, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min.
- Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l'anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l'esposizione dell'operatore isoflurano.
- Posto l'animale sul pre-tavolo operatorio collegato al flusso continuo di isoflurano. Quindi rimuovere il pelo dal arti posteriori con un rasoio elettrico seguito da crema di rimozione dei capelli, se necessario.
- Dopo aver rimosso i capelli,posto l'animale su una superficie di 37 ° C riscaldata per 5 minuti sotto flusso continuo di isoflurano. Monitorare la temperatura interna per assicurare euthermia, come sbalzi di temperatura sarà notevolmente influenzare la perfusione.
- Dopo 5 minuti, mettere l'animale in posizione supina su una base non-riflettenti che assorbono la luce di superficie come colore verde panno, collegato ad un flusso continuo di isoflurano. Estendere l'arti posteriori.
- Successivamente, accendere il laser Doppler imager e il software di acquisizione e inizializzare il software. Specificare la dimensione del campo visivo e la risoluzione. E 'meglio tenere il campo visivo e la densità dei pixel coerenti tra gli animali in modo da rendere più facile l'analisi future.
- Aprire un nuovo file. Premere start per iniziare l'acquisizione dei dati immagine. In generale, l'imager rileva automaticamente la distanza del mouse, ma se richiesto, specificare la distanza degli animali per l'imager. Il laser mostra i confini del campo di vista e quindi iniziare l'acquisizione dati.
- Dopo l'acquisizione è stata completata, l'immagine inizia a mostrare una gamma di colori che sono indicative del livello di perfusione di sangue alle gambe. I colori possono essere impostati per una vasta perfusione specifica per confrontare meglio i dati tra gli animali.
- Quando l'acquisizione dei dati è completa, salvare il file.
- Poi rispedire l'animale verso la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando l'animale sveglio.
- Per analizzare i dati, utilizzare la regolazione della soglia del software di analisi per sottrarre qualsiasi rumore di fondo. Una soglia di 0,2 di solito è un valore ragionevole. Selezionare 2 regioni di interesse, o ROI, che coprono ogni area degli arti posteriori. Una varietà di punti di riferimento possono essere utilizzate per standardizzare il ROI tra le arti e gli animali. Quindi determinare la perfusione media e variabilità del ROI. La differenza e il rapporto perfusione perfusione tra l'arto ischemico e degli arti di controllo può essere facilmente determinato.
- Questa procedura può essere ripetuta per seguire i cambiamenti della perfusione degli arti posteriori nel tempo. Ad un certo punto di tempo desiderato, l'animale può essere eutanasia per la valutazione della funzione di tessuti e di confronto per i dati delle immagini di perfusione.
3. Rappresentante dei risultati:
L'anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori è illustrato nella figura 1 2. Un diagramma rappresentante della arti posteriori dopo espianto arteria femorale è illustrato nella figura 2. Per confermare l'induzione di ischemia agli arti posteriori, l'analisi della perfusione laser Doppler immagine mostra una drastica riduzione del flusso di sangue per l'arto ischemico, rispetto al controllo degli arti, come mostrato nella Figura 3.
Figura 1. Anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori. Asterischi indicano le posizioni dei legatura per l'induzione di ischemia degli arti posteriori.
Figura 2. Diagramma rappresentante che mostra l'anatomia delle arti posteriori dopo la legatura dell'arteria femorale nei siti prossimale e distale dopo la rimozione l'arteria femorale.
Figura 3. Laser Doppler immagini che mostrano il flusso di sangue prima e dopo l'induzione di ischemia agli arti posteriori sinistra (indicato dalla freccia).
Discussion
Ci sono alcune fonti di variabilità di prendere in considerazione durante la pianificazione e l'esecuzione di modelli di ischemia degli arti posteriori. In primo luogo, il livello di ischemia può variare a seconda della posizione della legatura rispetto a quella dei rami laterali. Pertanto, per coerenza del modello, gli animali devono subire lo stesso livello di legatura arteriosa. Un'altra fonte di variabilità nel recupero ischemico è legato alla età degli animali, con gli animali giovani (6-8 settimane) con i tassi di recupero più veloce e più completa di animali più vecchi (8-10 mesi), valutata in base emodinamica (cioè laser Doppler perfusione) o funzionale (cioè di test tapis roulant) misure. Per gli studi in cui si sta valutando un agente angiogenico, può essere preferibile utilizzare animali più vecchi, perché la differenza maggiore tra i gruppi possono essere osservati con un intervento terapeutico. Al contrario, per gli studi in cui si sta valutando un anti-angiogenico fattore, può essere preferibile utilizzare animali più giovani per massimizzare la misura 3 effetto.
Se eseguito correttamente, ci dovrebbe essere complicazioni minime come sanguinamento, infezione, o la mortalità. Se l'emorragia si verifica dalla rottura accidentale della vena femorale o di altre navi, la pressione moderata con un applicatore con punta di cotone sterile o garza deve essere applicato al sito di emorragia fino a quando l'emorragia si ferma. Gli animali che presentano segni di infezione devono essere trattati con agenti anti-infettivi. Animali espositrici cancrena significativo potrebbe essere necessario beeuthanized. Questa complicanza è più comune negli animali più vecchi, e in alcuni ceppi, come topi BALB c 4. Inoltre, il modello di ischemia degli arti posteriori possono causare dolore da lieve a moderata. Pertanto, gli analgesici come la buprenorfina o carprofene deve essere somministrato come necessari per il trattamento del dolore, secondo le raccomandazioni del IACUC.
In conclusione, abbiamo dimostrato un metodo semplice e riproducibile per lo studio PAD in un modello murino di ischemia degli arti posteriori. Il modello di ischemia degli arti posteriori con l'analisi laser Doppler è un sistema eccellente per studiare patologie vascolari e per la valutazione dei candidati terapeutici.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e lo Small Animal Imaging Stanford Nucleo per l'assistenza tecnica. Gli autori hanno anche ringraziare AM Bickford, Inc. per il supporto di attrezzature veterinarie. Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca dal National Institutes of Health (R01 HL-75774, CA098303 R01, R21 HL085743, 1K12 HL087746), il tabacco California sul programma di ricerca sulle malattie della University of California (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e l'Istituto di Medicina Rigenerativa della California (RS1-00183). NH è sostenuto da una borsa di studio della American Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
