Summary
O procedimento cirúrgico para a indução de isquemia hindlimb unilateral é demonstrada, com a confirmação de isquemia por laser Doppler imagens de perfusão.
Abstract
Nos Estados Unidos, a doença arterial periférica (DAP) afeta cerca de 10 milhões de indivíduos, e é também mundialmente prevalente. Terapias médicas para o alívio sintomático são limitadas. Intervenções cirúrgicas ou endovasculares são úteis para alguns indivíduos, mas a longo prazo os resultados são muitas vezes decepcionantes. Como resultado, há uma necessidade para o desenvolvimento de novas terapias para tratar a PAD. A preparação isquemia murino hindlimb é um modelo de PAD, e é útil para testar novas terapias. Quando comparado com outros modelos de isquemia tecidual como a ligadura da artéria coronária ou cerebral, ligadura da artéria femoral prevê um modelo mais simples de tecido isquêmico. Outras vantagens deste modelo são a facilidade de acesso para a artéria femoral e baixa taxa de mortalidade.
Neste vídeo, demonstramos a metodologia para o modelo murino de isquemia hindimb unilateral. Os materiais e procedimentos específicos para a criação e avaliação do modelo será descrita, incluindo a avaliação da perfusão do membro por laser Doppler. Este protocolo também pode ser utilizado para o transplante e não-invasiva de rastreamento de células, o que é demonstrado por Huang et al. 1.
Protocol
1. Indução de isquemia dos membros posteriores unilaterais
- Os instrumentos cirúrgicos necessários para esta operação são: multa fórceps pontiagudo, uma pinça pontiaguda, tesoura primavera, tesouras cirúrgicas, porta-agulhas e afastador. Nós fazemos nossa própria retrator usando um clipe de papel porque ele é menor do que retratores disponíveis comercialmente. Esterilizar essas ferramentas antes da cirurgia por uma autoclave ou um esterilizador hot-pérola. Uma ferramenta de cautério e estéril fino cotonetes apontou também será necessária para esta cirurgia. Recomenda-se que as ferramentas de ser re-esterilizados nas pontas, conforme necessário durante o procedimento.
- Quando as ferramentas estão prontas, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min.
- Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. Recomenda-se lavar o anestésico da caixa antes de abrir a tampa, para diminuir a exposição do operador para o isoflurano.
- Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal sobre a mesa pré-operacionais e conectá-lo a um fluxo contínuo de isoflurano. Usando um barbeador elétrico, remover os pêlos do membro posterior. Aplique o creme de depilação para remover completamente o cabelo.
- Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada coberta aquecida na mesa de operação, e conectá-lo a um fluxo contínuo de isoflurano. Ampliar e garantir o membro posterior com um pedaço de fita. Uma vez que o membro posterior é seguro, limpe a pele com três esfrega alternando betadine e álcool. Para o restante do procedimento cirúrgico, o uso de um microscópio de dissecação em 10X ou 20X de ampliação para obter uma visão ampliada da região hindlimb.
- Utilizando uma pinça fina e tesoura cirúrgica, fazer uma incisão na pele, de aproximadamente 1 cm de comprimento, a partir do joelho para a coxa medial.
- Usando tampão fosfato (PBS)-umedecidos multa cotonetes apontou, escove delicadamente afastado tecido adiposo subcutâneo em torno do músculo da coxa.
- Em seguida, aplique o cautério transversalmente ao inciso e dissecar através do tecido de gordura subcutânea para revelar a artéria femoral subjacente.
- Use um afastador para abrir o ferimento e obter uma melhor visualização da vasculatura dos membros inferiores.
- Utilizando uma pinça fina e um cotonete bem apontou, gentilmente furar através da bainha membranosa femoral para expor o feixe neurovascular.
- Em seguida, usando um jogo limpo de uma pinça fina e haste com algodão, dissecar e separar a artéria femoral a partir da veia femoral e do nervo no local proximal, perto da virilha. Após a dissecção, passe um fio de sutura de seda 7-0 debaixo da extremidade proximal da artéria femoral. Oclusão da artéria femoral proximal usando nós dobro. Coloque o empate na embarcação como proximal na ferida quanto possível a fim de deixar tempo para o empate segundo e um segmento de intervenção que será seccionado.
- Separe a artéria femoral da veia femoral no local distal perto do joelho. Passe um fio de sutura 7-0 debaixo da extremidade distal da artéria femoral proximal até a artéria poplítea. Oclusão do vaso usando nós dobro.
- Oclusão da artéria femoral distal com um segundo conjunto de nós dobro apenas proximal ao primeiro conjunto de nós. Este segundo conjunto de suturas serão usados para prender a artéria durante o processo de transação.
- Da mesma forma, para fins de emocionante, oclusão da artéria femoral proximal com um segundo conjunto de nós dobro imediatamente distal ao primeiro conjunto de nós.
- Transecto o segmento da artéria femoral entre os nós distal e proximal com um cotonete fino e pontudo e uma tesoura de mola. Tenha cuidado para não perfurar a parede da veia femoral.
- Remover o retrator e fechar a incisão usando Vicryl 5-0. Estas suturas não precisam ser removidos em um momento posterior, como eles se dissolvem sozinhos.
- Uma vez que a incisão é fechada, colocar o animal em cima de uma almofada coberta aquecida na gaiola de recuperação e monitorar continuamente até que desperto.
- Depois de origem animal se recuperou de uma hora, prossiga com o passo de perfusão do laser Doppler sangue, a fim de confirmar a indução de isquemia.
2. Laser Doppler perfusão sanguínea
- Para começar o laser Doppler perfusão passo, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min.
- Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. Recomenda-se lavar o anestésico da caixa antes de abrir a tampa, para diminuir a exposição do operador para o isoflurano.
- Colocar o animal na mesa pré-operacional conectado ao fluxo contínuo de isoflurano. Em seguida, retire o cabelo da hindlimb usando um barbeador elétrico seguido por creme de depilação, se necessário.
- Após a remoção do cabelo,colocar o animal em uma superfície de 37 ° C aquecidos por 5 minutos sob fluxo contínuo de isoflurano. Monitorar a temperatura do núcleo para garantir euthermia, como mudanças de temperatura irá afetar significativamente a perfusão.
- Após 5 minutos, colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma superfície não-reflexiva de absorção de luz, como pano de cor verde, conectado a um fluxo contínuo de isoflurano. Estender membros posteriores.
- Em seguida, ligue a impressora a laser Doppler e do software de aquisição e inicializar o software. Especificar o tamanho do campo de visão e resolução. É melhor para manter o campo de visão e densidade de pixels consistente entre os animais, a fim de tornar a análise futura mais fácil.
- Abra um novo arquivo. Prima start para iniciar a aquisição dos dados de imagem. Geralmente, o gerador de imagens detecta automaticamente a distância do mouse, mas se solicitado, especifique a distância do animal para o gerador de imagens. O laser vai mostrar as fronteiras do campo de visão e, em seguida, começar a adquirir dados.
- Após a aquisição for concluída, a imagem começará a mostrar uma gama de cores que são indicativos do nível de perfusão de sangue para as pernas. As cores podem ser definidas para uma gama específica de perfusão para melhor comparar os dados entre os animais.
- Quando a aquisição de dados estiver concluída, salve o arquivo.
- Em seguida, retornar o animal para a gaiola de recuperação e monitorar o animal continuamente até que desperto.
- Para analisar os dados, use o ajuste de limite no software de análise para subtrair qualquer ruído de fundo. Um limite de 0,2 geralmente é um valor razoável. Selecionar 2 regiões de interesse, ou ROIs, que cobrem cada área hindlimb. A variedade de pontos de referência pode ser usada para padronizar o ROI entre os membros e os animais. Em seguida, determinar a perfusão média e variabilidade no ROI. A diferença de perfusão e perfusão entre o membro isquêmico e membro de controle pode então ser facilmente determinada.
- Este procedimento pode ser repetido para acompanhar as alterações na perfusão hindlimb ao longo do tempo. Em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função do tecido e comparação com dados de imagem de perfusão.
3. Resultados representativos:
A anatomia da vasculatura hindlimb é mostrado na Figura 1 2. Um diagrama representativo da hindlimb após explante artéria femoral é mostrado na Figura 2. Para confirmar a indução de isquemia para o membro posterior, laser Doppler análise de imagens de perfusão demonstra uma redução dramática no fluxo sangüíneo para o membro isquêmico, em comparação com o membro de controle, como mostrado na Figura 3.
Figura 1. Anatomy da vasculatura hindlimb. Asteriscos indicam os locais de ligação para a indução de isquemia hindlimb.
Figura 2. Diagrama Representante mostrando a anatomia do membro posterior após a ligadura da artéria femoral na porção proximal e distal após a remoção da artéria femoral.
Figura 3. Laser Doppler imagens mostrando o fluxo de sangue antes e após a indução de isquemia para o membro posterior esquerda (indicada pela seta).
Discussion
Existem algumas fontes de variabilidade a considerar no planejamento e execução de modelos de isquemia hindlimb. Primeiro, o nível de isquemia pode variar de acordo com a localização da ligadura com relação ao de ramos laterais. Portanto, para a consistência do modelo, os animais devem ser submetidos ao mesmo nível de ligadura arterial. Outra fonte de variabilidade na recuperação isquêmica está relacionada com a idade dos animais, com animais jovens (6-8 semanas) com taxas de recuperação mais rápido e mais completo do que animais mais velhos (8-10 meses de idade), avaliado pela hemodinâmica (ie perfusão do laser Doppler) ou funcionais (teste ergométrico, por exemplo) medidas. Para estudos em que se está avaliando um agente angiogênico, pode ser preferível usar animais mais velhos, porque uma maior diferença entre os grupos pode ser observada com uma intervenção terapêutica. Por outro lado, para estudos em que se está avaliando um fator anti-angiogênico, pode ser preferível utilizar animais mais jovens para maximizar o tamanho do efeito 3.
Se realizado corretamente, deve haver o mínimo de complicações tais como hemorragia, infecção ou mortalidade. Se o sangramento ocorre por ruptura acidental da veia femoral ou outros recipientes, com uma pressão moderada de algodão estéril aplicador derrubado ou gaze deve ser aplicado no local da hemorragia até que o sangramento pare. Os animais que apresentem sinais de infecção devem ser tratados com agentes anti-infecciosos. Animais exibindo gangrena significativa pode precisar beeuthanized. Esta complicação é mais comum em animais mais velhos, e em algumas cepas, como camundongos BALB c 4. Além disso, o modelo de isquemia hindlimb pode causar a dor ligeira a moderada. Portanto, os analgésicos, como a buprenorfina ou carprofeno deve ser administrado conforme necessário para o tratamento de dor, de acordo com recomendações do IACUC.
Em conclusão, nós demonstramos um método simples e reprodutível para o estudo da PAD em um modelo murino de isquemia hindlimb. O modelo de isquemia hindlimb análise com laser Doppler é um excelente sistema para o estudo de patologias vasculares e de avaliação dos candidatos terapêuticos.
Acknowledgments
Os autores agradecem Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e Stanford Núcleo de Imagem de Pequenos Animais para assistência técnica. Os autores também agradecem AM Bickford, Inc. para suporte de equipamentos veterinários. Esta pesquisa foi suportada por concessões de pesquisa do National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), o Programa de Pesquisa do Tabaco Califórnia Related Disease da Universidade da Califórnia (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RS1-00183). NH é apoiado por uma bolsa da American Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
