Summary
Det kirurgiska ingreppet för induktion av ensidiga bakdelen ischemi visas, med bekräftelse av ischemi med laser Doppler perfusion imaging.
Abstract
I USA påverkar perifer arteriell sjukdom (PAD) cirka 10 miljoner individer, och är också utbrett över hela världen. Medicinska behandlingar för att lindra symtomen är begränsade. Kirurgiska eller endovaskulära interventioner är användbara för vissa individer, men långsiktiga resultat är ofta en besvikelse. Som ett resultat finns det ett behov av att utveckla nya terapier för behandling av PAD. Den murina bakdelen ischemi preparat är en modell av PAD, och är användbar för att testa nya terapier. I jämförelse med andra modeller av vävnad ischemi, såsom koronar-eller cerebral artär ligation ger lårbensartären ligation för en enklare modell av ischemisk vävnad. Andra fördelar med denna modell är enkel åtkomst till femoralis och låg dödlighet.
I denna video visar vi metoden för mus modell av ensidiga hindimb ischemi. De specifika material och metoder för att skapa och utvärdera modellen kommer att beskrivas, inklusive bedömning av perfusion med laser Doppler imaging. Detta protokoll kan också användas för transplantation och icke-invasiv spårning av celler, vilket framgår av Huang et al. 1.
Protocol
1. Induktion av ensidiga bakdelen Ischemi
- Den kirurgiska verktyg som behövs för denna operation är: fina spetsiga pincett, spetsiga pincett, sax våren, kirurgisk sax, nål och upprullningsdon. Vi gör våra egna upprullningsdon med hjälp av ett gem, eftersom det är mindre än kommersiellt tillgängliga upprullningsdon. Sterilisera dessa verktyg före operation av en autoklav eller en hot-pärla autoklav. En diatermi verktyg och sterila fina spetsiga kompresser bomull kommer också att behövas för denna operation. Det rekommenderas att de verktyg omsteriliseras på tips som behövs under förfarandet.
- När verktygen är färdiga, placera musen i anestesi induktion kammare som innehåller 1-3% isofluran i 100% syrgas med en flödeshastighet av 1L/min.
- Låt musen i induktionskammare tills det inte svarar på yttre stimuli. Ta sedan bort djuret från induktion kammaren. Det rekommenderas att spola bedövningsmedel från rutan innan du öppnar locket, för att minska operatörens exponering för isofluran.
- Placera sedan djuret i ryggläge på förhand operationsbordet och ansluta den till ett kontinuerligt flöde av isofluran. Använda en elektrisk rakapparat, ta bort hår från bakdelen. Applicera hårborttagningskräm att grundligt ta bort hår.
- Placera musen i ryggläge under en draperad uppvärmd dyna på operationsbordet, och koppla den till ett kontinuerligt flöde av isofluran. Utöka och säkra bakbenen med en bit tejp. När bakdelen är säker, torka av huden med tre omväxlande Betadine och alkohol scrubs. För resten av det kirurgiska ingreppet, använd en dissektion mikroskop vid 10X eller 20X förstoring för att få en förstorad bild av bakdelen regionen.
- Använda fin pincett och kirurgisk sax, gör ett snitt i huden, ca 1 cm lång, från knäet mot den mediala låret.
- Använda fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-fuktad fina spetsiga tops, försiktigt borsta bort underhudsfettet vävnaden som omger lårmuskeln.
- Därefter tillämpa kauterisation tvärs incisionsfilm och dissekera genom subkutan fettvävnad för att avslöja den underliggande lårbensartären.
- Använd ett upprullningsdon att öppna såret och för att få en bättre bild av nedre extremiteten kärlbädden.
- Använda fin pincett och en fin pekade bomullspinne, försiktigt tränga igenom membranös femorala slida att exponera neurovaskulära bunt.
- Använd sedan en ren uppsättning av fina pincett och bomullspinne, dissekera och separera lårbensartären från femoral ven och nerv i den proximala läge nära ljumsken. Efter dissektion, passerar en del av 7-0 silke sutur under proximala änden av lårbensartären. Täppa till proximala lårbensartären med dubbla knutar. Placera slips på fartyget som proximala i såret som möjligt för att lämna längd för den andra slips och en mellanliggande segment som kommer att transected.
- Separera femoralisartären från lårbenshals ven vid distala läge nära till knäet. Pass en del av 7-0 sutur under den distala änden av femoralartären proximalt Poplietallymfknutor artären. Täppa till fartyget med hjälp av dubbla knutar.
- Täppa till distala femoralis med en andra uppsättning av dubbla knutar strax proximalt om den första uppsättningen knop. Denna andra uppsättning av suturer kommer att användas för att ta tag i artär under transaktionen förfarandet.
- Likaså för att gripa ändamål, täppa till proximala femoralis med en andra uppsättning av dubbla knutar precis distalt om den första uppsättningen knop.
- Transekt segmentet i lårbensartären mellan distala och proximala knop med en fin pekade bomullstuss och ett par av vårens sax. Var försiktig att inte tränga igenom femoral ven väggen.
- Ta upprullningsdonet och stäng snitt med 5-0 Vicryl suturer. Dessa suturer behöver inte tas bort vid ett senare tillfälle, eftersom de löser på egen hand.
- När snittet är stängd, placera djuret på toppen av en draperad uppvärmd pad i återhämtningen bur och övervakar kontinuerligt tills vaken.
- Efter att djuret har återhämtat sig under 1 timme, gå vidare med laser Doppler blodet perfusionen steg för att bekräfta ischemi induktion.
2. Laser Doppler Blood perfusion
- Till att börja laser Doppler perfusion steg, placera musen i anestesi induktion kammare som innehåller 1-3% isofluran i 100% syrgas med en flödeshastighet av 1L/min.
- Låt musen i induktionskammare tills det inte svarar på yttre stimuli. Ta sedan bort djuret från induktion kammaren. Det rekommenderas att spola bedövningsmedel från rutan innan du öppnar locket, för att minska operatörens exponering för isofluran.
- Placera djuret på förhand operationsbordet ansluten till kontinuerligt flöde av isofluran. Ta sedan bort håret från bakdelen med hjälp av en elektrisk rakapparat följt av hårborttagning grädde efter behov.
- Efter att håret,Placera djuret på ett 37 ° C uppvärmda ytan i 5 minuter under ständig ström av isofluran. Övervaka kärntemperatur för att säkerställa euthermia, eftersom temperaturförändringar kommer att markant påverka perfusion.
- Efter 5 minuter, placera djuret i ryggläge på en icke-reflekterande ljusabsorberande yta såsom grön-färgade tyg, kopplad till ett kontinuerligt flöde av isofluran. Förläng bakben.
- Därefter sätter på laser Doppler Imager och förvärvet programvara och initiera programmet. Ange storleken på synfältet och upplösning. Det är bäst att hålla synfältet och pixeltätheten konsekvent mellan djur för att göra framtida analyser enklare.
- Öppna en ny fil. Tryck på start för att börja förvärva bilddata. Generellt, känner kameran automatiskt avståndet till musen, men om du uppmanas ange avståndet av djuret till kameran. Lasern visar gränser synfältet och sedan börja skaffa information.
- Efter förvärvet är klar kommer bilden att börja visa ett urval av färger som indikerar nivån av blod genomblödning i benen. Färgerna kan ställas in för ett specifikt perfusion sortiment för att bättre jämföra data mellan djur.
- När datainsamling är klar, spara filen.
- Sen tillbaka djuret till återhämtning buren och övervaka djur kontinuerligt tills vaken.
- För att analysera data, använd tröskeln justering av analysprogram för att subtrahera alla bakgrundsljud. En tröskel på 0,2 är oftast ett rimligt värde. Välj 2 regioner av intresse, eller Rois, som täcker varje bakdelen område. En mängd olika landmärken kan användas för att standardisera de ROI mellan benen och djur. Sedan bestämma medelvärdet perfusion och variation i avkastning. Den perfusion skillnad och perfusion förhållandet mellan ischemiska extremiteten och kontroll lem kan då lätt bestämmas.
- Denna procedur kan upprepas för att följa förändringar i bakdelen perfusion över tiden. Vid önskad tidpunkt, kan djuret avlivas för bedömning av vävnad funktion och jämförelse av uppgifter perfusion bild.
3. Representativa resultat:
Anatomin i bakdelen kärlsystemet visas i figur 1 2. En representant schema över bakdelen efter femoralisartären borttagning visas i figur 2. För att bekräfta induktion av ischemi i bakbenen, visar laser Doppler perfusion bildanalys en dramatisk minskning av blodflödet till ischemiska extremiteten, i jämförelse med kontrollgruppen lem, som visas i figur 3.
Figur 1. Anatomi bakdelen kärlbädden. Asterisker anger placeringen av ligation för induktion i bakdelen ischemi.
Figur 2. Representant diagram som visar anatomin i bakbenen efter ligation av femoralartären i proximala och distala platser efter avlägsnande av femoralartären.
Figur 3. Laser Doppler bilder som visar blodflödet före och efter induktion av ischemi till vänster bakbenen (anges med pil).
Discussion
Det finns några källor till variabilitet att beakta i planeringen och genomförandet bakdelen ischemi modeller. Första kan graden av ischemi varierar beroende på var de ligering med avseende på den av sidogrenar. Därför för konsekvens av modellen, bör djuren genomgå samma nivå av arteriell ligatur. En annan källa till variabilitet i ischemisk återhämtning är relaterad till åldern på de djur, med unga djur (6-8 veckor) med snabbare och mer fullständig återhämtning priser än äldre djur (8-10 månader), som bedöms av hemodynamiska (dvs. laser Doppler perfusion) eller funktionella (dvs. löpband test) åtgärder. För studier där man bedömer en angiogena agent, kan det vara bättre att använda äldre djur, eftersom en större skillnad mellan grupperna kan ses med en terapeutisk intervention. Omvänt, för studier där man bedömer ett anti-angiogena faktorn, kan det vara bättre att använda yngre djur för att maximera 3 effektstorlek.
Om det utförs korrekt, borde det vara minimal komplikationer som blödningar, infektion eller dödlighet. Om blödning uppstår genom oavsiktlig störning av den femorala ven eller andra fartyg, måttligt tryck med en steril bomull tippas applikator eller gasbinda bör tillämpas på platsen för blödning tills blödningen stannar. Djur som visar tecken på infektion ska behandlas med anti-infektiösa agens. Djur som uppvisar betydande kallbrand kan behöva beeuthanized. Denna komplikation är vanligare hos äldre djur, och i vissa stammar, som BALB c möss 4. Dessutom kan den bakdelen ischemi-modellen orsaka mild till måttlig smärta. Därför bör analgetika såsom buprenorfin eller karprofen ges som behövs för behandling av smärta, enligt rekommendationer från IACUC.
Sammanfattningsvis har vi visat en enkel och reproducerbar metod för att studera PAD i en mus-modell i bakdelen ischemi. Den bakdelen ischemi modellen med laser Doppler bildanalys är ett utmärkt system för att studera vaskulära sjukdomar och för bedömning av terapeutiska kandidater.
Acknowledgments
Författarna tackar Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, VD, Tim Doyle, PhD, och Stanford Small Animal Imaging Core för tekniskt stöd. Författarna tackar också AM Bickford, Inc. för att stödja veterinär utrustning. Denna forskning stöddes av forskningsanslag från National Institutes of Health (R01 HL-75.774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California tobaksrelaterade sjukdomar Research Program vid University of California (15IT-0257 och 1514RT-0169) och California Institute för regenerativ medicin (RS1-00.183). NH stöds av ett stipendium från American Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
