Summary
Lazer Doppler perfüzyon sintigrafisi ile iskemi onayı ile tek taraflı hindlimb iskemi indüksiyonu için cerrahi işlem olduğunu göstermiştir.
Abstract
Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 10 milyon bireylerin, periferik arter hastalığı (PAH) etkiler, hem de dünya çapında yaygın. Tıbbi tedaviler semptomatik rahatlama için sınırlıdır. Cerrahi ya da endovasküler girişimlerin bazı kişiler için faydalı, ancak uzun vadeli sonuçlar genellikle hayal kırıklığı. Sonuç olarak, PAD tedavisinde yeni tedaviler geliştirmek için bir ihtiyaç var. Fare hindlimb iskemi hazırlık PAD bir model ve yeni tedavilerin test etmek için yararlıdır. Doku iskemisi, koroner veya serebral arter ligasyonu gibi diğer modeller ile kıyaslandığında, femoral arter ligasyonu, basit bir model için iskemik doku sağlar. Bu modelin diğer avantajları femoral arter ve düşük ölüm oranı erişim kolaylığı.
Bu video, tek taraflı hindimb iskemi fare modeli için metodoloji ortaya koymaktadır. Ekstremite perfüzyon lazer Doppler görüntüleme yöntemi ile değerlendirilmesi de dahil olmak üzere, model oluşturma ve değerlendirilmesi için özel malzemeler ve usulleri açıklanacaktır. Bu protokol aynı zamanda Huang ve ark tarafından gösterilmiştir hücreleri, 1 nakli ve non-invazif izleme için kullanılabilir .
Protocol
1. Tek taraflı Hindlimb İskemi indüksiyonu
- Bu işlem için gerekli cerrahi aletler şunlardır: ince sivri forseps, sivri forseps, yaylı makas, cerrahi makas, iğne tutucu ve retraktörü. Piyasada bulunan retraktörlere daha küçüktür, çünkü bir ataç kullanarak kendi retraktörü olun. Bu araçların bir otoklav veya sıcak bir boncuk sterilizatör cerrahi öncesi sterilize edin. Koter aracı ve steril ince sivri pamuklu de bu ameliyat için gerekli olacaktır. Bu araçlar, işlem sırasında gerekli ipuçlarını yeniden sterilize edilmesi tavsiye edilir.
- Araçları hazır olduğunuzda, anestezi indüksiyon odasına 1L/min bir akış hızında% 100 oksijen izofluran% 1-3 içeren fare yerleştirin.
- Dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Ardından indüksiyon odasından hayvan çıkarın. Izofluran için operatör maruziyeti azaltmak için, kapağı açmadan önce anestezi kutusundan temizlemek için tavsiye edilir.
- Sonra öncesi işletim masaya yatar pozisyonda hayvan ve izofluran bir sürekli akış bağlayın. Bir elektrikli tıraş makinesi, saç hindlimb çıkarın. Iyice saç kaldırmak için saç dökücü krem uygulayın.
- Fare dökümlü ısıtılmış yüzey üzerinde ameliyat masasına supin pozisyonda yerleştirin ve izofluran bir sürekli akış bağlayın. Genişletir ve bir parça bant ile hindlimb güvenli. Hindlimb güvenli sonra, üç alternatif betadin ve alkol scrubs ile cilt silin. Cerrahi işlemin geri kalanı için, 10X veya 20X büyütme hindlimb bölgenin büyütülmüş bir görünüm elde etmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
- İnce forseps ve cerrahi makas kullanarak, diz medial uyluk doğru yaklaşık 1 cm uzunluğunda, deride bir kesi yapmak.
- Fosfat kullanarak tamponlu salin (PBS) uyluk kas çevreleyen cilt altı yağ dokusu uzak fırça hafif, ince sivri pamuklu nemlendirilmiş.
- Sonra, enine koter insizyon ve derialtı yağ dokusu aracılığıyla incelemek için altta yatan femoral arterden ortaya çıkarmak için de geçerlidir.
- Yara açmak ve bir retraktörü alt ekstremite vaskülatürü daha iyi bir görünüm elde etmek için kullanın.
- Nörovasküler demet maruz membranöz femoral kılıf aracılığıyla nazik, ince forseps ve sivri uçlu ince bir pamuklu çubukla delmeyin kullanma.
- Sonra, ince forseps ve pamuklu temiz bir kümesini kullanarak, incelemek ve kasık yakın proksimal yerde femoral ven ve sinir femoral arterden ayrı. Diseksiyonu sonra, femoral arter proksimal ucunun altında 7-0 ipek sütür bir iplikçik geçmektedir. Çift knot kullanarak proksimal femoral arterden tıkamaktadır. Ikinci kravat ve transeksiyon olacak bir müdahale segmentinde uzunluğu bırakmak için mümkün olduğunca yara proksimal olarak gemide kravat yerleştirin.
- Femoral arter, distal yerde diz yakın femoral ven ayırın. Popliteal arter proksimal femoral arter distal ucu altında 7-0 dikiş teli geçirin. Çift knot kullanarak geminin tıkamaktadır.
- Knot ilk seti sadece proksimal çift knot ikinci bir set ile distal femoral arterden tıkamaktadır. Bu ikinci dikişlerle işlem prosedürü sırasında arter sürükleyici için kullanılacaktır.
- Benzer şekilde, sürükleyici amaçlar için, knot ilk seti sadece distal çift deniz mili ikinci bir set ile proksimal femoral arterden tıkamaktadır.
- Ince uçlu bir pamuklu çubukla ve bir çift yaylı makas ile distal ve proksimal knot arasında femoral arter segment transect. Femoral ven duvarı delmek için dikkatli kullanın.
- Retraktörü çıkarın ve 5-0 vicryl sütürler kullanarak kesi yakın. Bu dikişler kendi erimesi gibi, daha sonraki bir zamanda kaldırılması gerekmez.
- Kesi kapatıldıktan sonra, kurtarma kafes dökümlü ısıtmalı bir ped üstünde hayvan ve uyanık kadar sürekli izlemek.
- 1 saat süreyle hayvan kurtarıldı sonra, iskemi indüksiyon onaylamak için lazer Doppler kan perfüzyon adım ile devam edin.
2. Lazer Doppler Kan Perfüzyon
- Lazer Doppler perfüzyon adım başlamak için fare 1L/min bir akış hızında% 100 oksijen izofluran% 1-3 içeren anestezi indüksiyon odasına koyun.
- Dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Ardından indüksiyon odasından hayvan çıkarın. Izofluran için operatör maruziyeti azaltmak için, kapağı açmadan önce anestezi kutusundan temizlemek için tavsiye edilir.
- Izofluran sürekli akışına bağlı öncesi ameliyat masasında hayvan yerleştirin. Sonra gerekli saç dökücü krem takip elektrikli tıraş makinesi kullanarak hindlimb saç kaldırmak.
- Saç çıkardıktan sonra,izofluran sürekli akış altında 5 dakika süreyle 37 ° C ısıtılmış yüzey üzerindeki hayvan koyun. Euthermia sağlamak için sıcaklık değişiklikleri belirgin perfüzyon etkileyecek gibi, çekirdek sıcaklığının izleyin.
- 5 dakika sonra, yeşil renkli bir bez gibi bir sürekli akış izofluran bağlı olmayan bir yansıtıcı yüzey, ışık emici yatar pozisyonda hayvan koyun. Arka ayaklarında uzatın.
- Sonra, lazer Doppler görüntüleyici ve kazanım yazılım açmak ve yazılım başlatılamadı. Görünümü ve çözünürlük alanın boyutunu belirtin. Bu gelecek analizi kolaylaştırmak için hayvanlar arasında tutarlı bir görünüm ve piksel yoğunluğu alanında tutmak en iyisidir.
- Yeni bir dosya açın. Görüntü verilerini elde başlamak için tuşuna basın. Genellikle, fare mesafe görüntüleyici otomatik olarak algılar, ancak istenirse, görüntüleyici hayvan uzaklığı belirtmek. Lazer görüş alanı sınırları ve daha sonra veri elde başlayacaktır.
- Satın alma tamamlandıktan sonra, görüntü, bacaklarda kan perfüzyonunun düzeyinin göstergesi renkleri bir dizi göstermeye başlayacaktır. Renkler daha iyi hayvanlar arasındaki verileri karşılaştırmak için belirli bir perfüzyon aralığı ayarlanabilir.
- Veri toplama işlemi tamamlandığında, dosyayı kaydedin.
- Sonra hayvan kurtarma kafes ve hayvan uyanık kadar sürekli izlemek.
- Verileri analiz etmek, herhangi bir arka plan gürültü çıkarmak için analiz yazılımı eşik ayarı kullanın. Bir eşik 0.2 genellikle makul bir değerdir. 2 ve her hindlimb alanı kapsayacak ilgi bölgelerde, ya da ROI'ler, seçin. Çeşitli yerlerinden, bacaklarda ve hayvanlar arasındaki yatırım getirisi standartlaştırmak için kullanılabilir. Sonra yatırım getirisi ortalama perfüzyon ve değişkenlik belirler. Iskemik ekstremite ve kontrol bacak arasında perfüzyon farkı ve perfüzyon oranı daha sonra kolayca tespit edilebilir.
- Bu prosedür, zaman içinde hindlimb perfüzyon değişiklikleri takip tekrar edilebilir. Istenilen bir zaman noktasında, hayvan doku fonksiyon ve perfüzyon görüntü verilerini karşılaştırma değerlendirilmesi için ötenazi olabilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1 2 hindlimb damarsal anatomi gösterilmiştir. Femoral arterden eksplantasyonu sonra hindlimb bir temsilci diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir. Hindlimb iskemi indüksiyon onaylamak için Şekil 3'te gösterildiği gibi, lazer Doppler perfüzyon görüntü analizi, kontrol uzuv karşılaştırıldığında, iskemik ekstremite kan akışını dramatik bir azalma gösterir.
Şekil 1 hindlimb damarsal anatomisi. Asteriskler hindlimb iskemi indüksiyonu için ligasyonu yerleri göstermektedir.
Şekil 2, femoral arter çıkarıldıktan sonra proksimal ve distal sitelerde femoral arter ligasyonu sonra hindlimb anatomisini gösteren Temsilcisi bir diyagram.
Şekil 3. sol hindlimb (ok ile gösterilen) iskemi indüksiyon öncesi ve sonrası kan akışını gösteren Laser Doppler görüntüleri.
Discussion
Planlama ve hindlimb iskemi modelleri yaparken göz önünde değişkenlik bazı kaynaklar vardır. İlk olarak, iskemi yan dalları ile ilgili ligasyonu konuma göre değişebilir. Bu nedenle, modelin tutarlılığı için, hayvanların aynı düzeyde arter ligasyonu geçmelidir. Başka bir kaynaktan, yaşlı hayvanların (8-10 aylık) çok daha hızlı ve daha tam iyileşme oranları olan genç hayvanlarda (6-8 hafta), iskemik kurtarma değişkenlik hayvanların yaşı ile ilgili olarak (yani hemodinamik tarafından değerlendirildi lazer Doppler perfüzyon) veya fonksiyonel (yani koşu bandı test) ölçer. Terapötik bir müdahale ile gruplar arasında büyük bir fark görülebilir, çünkü biri anjiyogenik ajan değerlendirmek olduğu çalışmalar için, eski hayvan kullanmak için tercih edilebilir. Tersine, bir bir anti-anjiogenik faktör değerlendirirken olduğu çalışmalar için, en üst düzeye çıkarmak için etki büyüklüğü 3 genç hayvanlar tercih olabilir.
Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, kanama, enfeksiyon, ya da ölüm gibi minimal komplikasyon olması gerekir. Eğer kanama femoral ven veya diğer gemiler, steril bir pamuk ile orta basınç yanlışlıkla kesintiye uğraması ile oluşur uçlu bir aplikatör veya gazlı bez kanama site kanama durana kadar uygulanmalıdır. Enfeksiyon belirtileri gösteren hayvanlar, anti-enfektif ajanlar ile tedavi edilmelidir. Önemli kangren sergileyen Hayvanlar beeuthanized gerekebilir. Bu komplikasyon, yaşlı hayvanlarda daha sık görülür ve BALB c farelerde 4 olarak bazı suşları, . Buna ek olarak, hindlimb iskemi modeli, orta derecede ağrısı hafif neden olabilir. Bu nedenle, buprenorfin veya carprofen gibi analjezikler ağrı tedavisi için gerekli IACUC tavsiyelere göre, idare edilmelidir.
Sonuç olarak, biz hindlimb iskemi bir fare modeli PAD eğitimi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymuştur. Hindlimb iskemi modeli lazer Doppler görüntüleme analizi ile vasküler patolojilerin incelenmesi ve tedavi adayları değerlendirmek için mükemmel bir sistem.
Acknowledgments
Yazarlar Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Hibe Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, Doktora ve teknik yardım için Stanford Küçük Hayvan Imaging Core teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca veteriner ekipman desteği için teşekkür ederiz. AM Bickford, Inc. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri araştırma hibeler (R01 HL-75.774, R01 CA098303, R21 HL085743 1K12 HL087746), California University of California (15IT-0257 ve 1514RT-0169) Tütün İlgili Hastalık Araştırma Programı tarafından desteklenen ve Rejeneratif Tıp California Institute (RS1-00.183). NH bir burs Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
