Biology

Upptäckt och isolering av Livskraftiga Mouse IL-17-utsöndrar T-celler

Published: December 18, 2008 doi: 10.3791/1037

Anna Foerster¹, Mario Assenmacher¹, Michaela Niemoeller¹, Elly Rankin¹, Mariette Mohaupt¹, Anne Richter¹

Summary

Denna procedur beskriver detektering och isolering av mus TH17 leukocyter som aktivt utsöndrar IL-17 vid stimulering.

Abstract

Den MACS Cytokine Sekretion analys teknik kan upptäcka utsöndras cytokiner om den inre cellnivå och känsliga isolering av livskraftiga cytokin-celler som utsöndrar. För att märka IL-17-celler som utsöndrar, en enda cell suspension av mus splenocytes är beredd och stimuleras på 37 ° C med PMA / ionomycin att inducera cytokin sekretion. För att stoppa sekretion celler placeras sedan på is och är utsatta för IL-17 Catch Reagent en bi-specifik antikropp som binder till CD45 på cellytan av leukocyter och IL-17 som det utsöndras och fångade nära cellytan. Sekretion är sedan startas genom att öka temperaturen till 37 ° C och IL-17 är fångade i Catch reagens. Sekretion Då avslutar igen, genom att placera celler på is. För att upptäcka de fångade IL-17, är celler inkuberas med en andra IL-17-specifik antikropp konjugerad till biotin och ett anti-Biotin-PE-antikroppen. Celler kan nu direkt analyseras med flödescytometri eller förberedda för isolering och anrikning av senare märkning med Anti-PE-konjugerade mikrokulor.

Protocol

Förbereda Reagenser

Gör en buffert som innehåller PBS med BSA (0,5%) och 2 mM EDTA. Eftersom luftbubblor kan blockera MACS Separationskolonner behöver bufferten vara avgasade och lagras vid 2-8 ° C före användning.
Vi använder RPMI 1640 medium som innehåller 5% mus serum. Odlingsmediet ska inte innehålla BSA eller FCS, eftersom dessa föreningar kommer att förändra specificitet cellen stimulering.
Musen IL-17 Sekretion-analys - Cell anrikning och Detection Kit från Miltenyi-Biotec. Satsen innehåller följande komponenter: IL-17 Catch Reagens, IL-17 detektionsantikropp (Biotin), Anti-Biotin-PE, och Anti-PE mikrokulor.

Stimulera Splenocytes

Detta protokoll sker i närvaro av en negativ och positiv kontroll, såsom ostimulerade splenocytes och en motfärg för T-celler. Detta protokoll utförs med steril teknik.
Förbered en enda cell suspension av mus splenocytes som var isolerade med gentleMACS ™ Dissociator. Koncentrationen av celler bör förutbestämd via cell räkna. Pellets cellerna på 200 × gi 10 minuter vid rumstemperatur.
Efter centrifugering, aspirera supernatanten från pelleten med hjälp av en pipett. Inte dekantera röret för att undvika förlust av pelleten.
Nu resuspendera cellerna i odlingsmedium och sedan lägga till en brunn. Lägg tillräckligt med medel för en koncentration på tio miljoner celler per ml och fem miljoner celler per kvadrat cm.
För att stimulera ett immunsvar i våra återsuspenderade celler, lägger vi ionomycin (1 mikrogram / ml) och PMA (10 ng / ml) till provet och blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ned. Sedan brunnarna är märkta därefter.
Nu kommer vi att inkubera våra celler i 3 timmar vid 37 ° C utan att blanda för att starta stimuleringen period. Fortsätt till IL-17 analys 3 timmar från debuten av stimulans, så planera därefter.
För att stoppa sekretion, celler placeras på is och vi samlar de stimuleras cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ned med kall buffert. Celler överförs sedan från brunnen till ett rör och tvättas en andra gång.
För att säkerställa att alla celler samlas, är det en bra idé att kontrollera din maträtt i mikroskop. Om celler fortfarande sitter kvar kan du samla de kvarvarande cellerna genom att skölja skålen med kall buffert. Varje cell klumpar i din cellsuspension kan tas bort med före separationen filter.

Märkning Celler med Catch Reagens

Det är ytterst viktigt att notera att denna analys fungerar optimalt om mindre än 2% av IL-17-celler som utsöndrar är närvarande.
Om koncentrationen av IL-17 celler som utsöndrar förväntas vara större än 2% justera volymen därefter.
En potentiell fallgrop med detta förfarande är korskontaminering av fångsten Reagent, som kan uppstå under märkning när bi-specifik antikropp binder till ett icke-utsöndrar T-cell och fällor IL-17 som utsöndras från en angränsande lymfocyter, och därmed generera falska positiva.
För att kringgå detta problem är det viktigt att kyla celler nedåt före märkning och arbeta med kallt buffert för att bromsa spridningen av IL-17 och undvika detta korskontaminering. Förutom att hålla cellerna kallt, måste de förvaras vid en definierad koncentration.
Till att börja märkning förfarande, använder vi tio miljoner celler i ett 15 ml förslutbar rör. Om högre cell nummer måste användas, helt enkelt skala upp alla volymer därefter. När den optimala cellkoncentrationen har erhållits, tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml kallt buffert.
Snurra ned cellerna vid 300 × gi 10 minuter i en kyld centrifug (2-8 ° C).
Efter centrifugering, aspirera supernatanten helt med hjälp av en pipett. Inte dekantera supernatanten eftersom detta kommer att leda till cell förlust och oprecisa volymer. Upprepa tvättningen steg som består i att tillsätta 10 ml av kallt buffert, centrifugering, och aspiration.
Nu när vi har en pellet av önskad renhet, resuspendera cellerna i 80 mikroliter av kalla odlingsmedium. Att märka dem, kommer vi nu lägga till 20 mikroliter av Mouse IL-17 Catch reagens.
Inkubera cellerna i 5 minuter på is.
Efter 5 minuters inkubationstid på is, ta bort röret och späd cellerna i 10 ml 37 ° C varmt medium. Fäst sedan slangen på MACSmix Tube Rotator och inkubera röret vid 37 ° C i 45 min under ständig rörelse. Öka temperaturen till 37 ° C startas om cytokin sekretion.

Märkning av celler med IL-17 detektionsantikropp (Biotin) och Anti-Biotin-PE

Efter 45 minuter sekretion period vid 37 ° C, placera röret omedelbart på is. Detta stoppar cytokin sekretion. Härifrån är det viktigt att hålla cellerna på is.Arbeta med kall buffert kommer att undvika korskontaminering av fångsten reagens.
Fyll röret med kall buffert och centrifugera vid 300xg vid 2-8 ° C i 10 min. Aspirera supernatanten helt. Upprepa tvättningen ytterligare en gång.
Cellpelleten är suspenderade i 80 mikroliter av köld buffert och röret läggs på is.
För att undvika ospecifik bindning av antikroppar rekommenderar vi att tillsätta 10μl FCR Blocking Reagent och inkubera på is i 5 min. Då kan vi lägga till 20 mikroliter av Mouse IL-17 detektionsantikropp (Biotin) som är konjugerad till biotin och inkubera i 10 minuter på is.
Än en gång, tvätta celler som vi har gjort tidigare genom att tillsätta 10 ml kallt buffert och centrifugera vid 300xg vid 2-8 ° C i 10 min.
Nu Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 80 l kall buffert.
Tillsätt 20 mikroliter av våra sekundär antikropp, anti-Biotin-PE.
Blanda celler och sekundär antikropp lösning, och igen inkubera röret i 10 minuter på is.
När denna andra inkubation är klar, tvätta cellerna med 10 ml kallt buffert och centrifugera.
Den pellets kan nu resuspenderas i 500 mikroliter av kall buffert.
Om cellerna måste separeras för vidare analys kan de vara magnetiskt märkta med Anti-PE-mikrokulor och separeras manuellt eller automatiskt med MACS Kolumner och MACS separatorer.
Vi har nu slutfört märkning av splenocytes och är redo för analys.

FACS analys

För vår analys kommer vi att jämföra stimuleras och ostimulerade splenocytes med flödescytometri.
Innan flödescytometrisk analys, är cellerna färgas med propidiumjodid på 0,5 mikrogram / ml till grinden ut döda celler. Den MACSQuant ™ Analyzer var lastad med 200.000 celler för varje prov och vi nu kommer att titta på scatter tomter av relativ antikroppar reaktivitet i proverna. Två viktiga faktorer för analys av sällsynta celler - som IL-17 positiva celler - med flödescytometri är:
- sätta en gate på lymfocyter i Forward Scatter kontra sidan punktdiagram
- och slussning ut döda celler (färgas med propidiumjodid) och B-celler (som kan orsaka ospecifik bakgrundsfärgning) för att ytterligare öka känsligheten för upptäckt
Vi använde CD4-APC antikroppar för att detektera T-celler och CD45R/B220-PerCP antikroppen att upptäcka B-celler. Vi ser framåt och Side Scatter egenskaper av proverna och tillämpa en gate på lymfocyter befolkningen.
En andra porten tillämpades för att se färgade döda celler och färgas B-celler (Y-axel). Dessa celler är undantagna från T-cell analys.
I detta exempel som i grunden är vår negativa kontroll, kan vi se att det finns mycket få IL-17 utsöndrar CD4 positiva T-celler i ostimulerade prover - ca 0,003% (Figur 4). Om man tittar på stimuleras T-cell population, kan vi se ett stort antal CD4 positiva T-celler som utsöndrar IL-17 - ca 0,367% (figur 5a) innan separationen och 60,76% efter magnetisk separation med MACS teknik (Figur 5B).

Discussion

TH17 celler spelar en viktig roll inom adaptiv immunitet och det inflammatoriska svaret och är en nyckelkomponent i körning autoimmun inflammation.

Denna video dokument hur du använder Miltenyi mus IL-17 Sekretion-analys - Cell anrikning och Detection Kit (PE). När du gör detta förfarande är det viktigt att ha en uppskattning av frekvensen av IL-17-celler som utsöndrar i din start cellberedningen. Lämplig cellkoncentrationen under märkning och cytokin sekretion perioden förhindrar korskontaminering med andra celler i din fjädring och försäkrar tillförlitliga resultat.

Disclosures

Alla protokoll och datablad finns på www.miltenyibiotec.com.

Varningar
Reagenser innehåller natriumazid. Under sura förhållanden natriumazid hydrazinsyra, som är extremt giftigt. Azidföreningar bör spädas med rinnande vatten innan de kasseras. Dessa försiktighetsåtgärder rekommenderas för att förhindra avlagringar i avlopp där explosiva förhållanden kan uppstå.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE)	Reagent	Miltenyi Biotec	130-094-213	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx
RPMI 1640	Medium	Miltenyi Biotec	130-091-440	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx
CD4-APC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-611	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx
CD8a-FITC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-605	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
Propidium Iodide Solution	Reagent	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
FcR Blocking reagent, mouse	Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
Dead Cell Removal Kit	Reagent	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACSmix Tube Rotator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
gentleMACS™ Dissociator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
autoMACS Pro Starting Kit	Instrument	Miltenyi Biotec	130-092-545	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx
MACS Columns	Tool	Miltenyi Biotec		http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
MACS Separator	Tool	Miltenyi Biotec