Summary
اختبار الانتقال الضوء / الظلام هي واحدة من أكثر الاختبارات المستخدمة على نطاق واسع لقياس القلق تشبه السلوك في الفئران. هنا ، ونحن تقديم الفيلم الذي يعرض على إجراءات تفصيلية حول كيفية اجراء الاختبار.
Abstract
على الرغم من أنه تم تحديد كل من تسلسل جينوم الفأر ، ونحن لا نعرف حتى الآن وظائف معظم هذه الجينات. الجينات التي تستهدف التقنيات ، ومع ذلك ، يمكن أن تستخدم لحذف أو التعامل مع جين معين في الفئران. ويمكن بعد ذلك من تأثير جين معين على سلوك معين يتم تحديدها عن طريق إجراء التحاليل السلوكية للفئرانا معدلة وراثيا. كاختبار لphenotyping السلوكية للفئرانا معدلة وراثيا ، واختبار الانتقال الضوء / الظلام هي واحدة من أكثر الاختبارات المستخدمة على نطاق واسع لقياس القلق تشبه السلوك في الفئران. ويستند الاختبار على النفور من الفئران الطبيعية إلى مناطق مضيئة وبراقة على سلوكهم العفوي استكشافية في بيئات جديدة. اختبار حساسة للعلاج بالعقاقير مزيل القلق. الجهاز يتكون من غرفة مظلمة وغرفة مضاءة الزاهية. ويسمح للفئران على التحرك بحرية بين الغرفتين. قضى عدد الإدخالات في غرفة مشرق ومدة من الوقت هناك مؤشرات ساطعة الفضاء القلق لدى الفئران. للحصول على نتائج phenotyping سلالة من الفئران الطافرة التي يمكن أن تتكرر بسهولة ومقارنتها مع تلك المسوخ أخرى ، ينبغي أن تكون طرق الاختبار السلوكية متطابقة ممكن بين المختبرات. الاختلافات الإجرائية التي توجد بين المختبرات ، ومع ذلك ، تجعل من الصعب تكرار أو مقارنة بين نتائج المختبرات. هنا ، ونحن لدينا بروتوكول الحالي لاختبار الانتقال الضوء / الظلام كفيلم بحيث يمكن البرهنة على تفاصيل البروتوكول. في المختبر لدينا ، وقد قمنا بتقييم أكثر من 60 سلالات من الفئران الطافرة باستخدام بروتوكول يظهر في الفيلم. وسيتم الكشف عن هذه البيانات باعتبارها جزءا من قاعدة بيانات عامة أن نقوم ببناء الآن.
والتصور للبروتوكول تيسير فهم تفاصيل الإجراء التجريبي كامل ، والسماح لتوحيد البروتوكولات المستخدمة في المختبرات ومقارنات بين الظواهر السلوكية للسلالات مختلفة من الفئران الطافرة المقررة باستخدام هذا الاختبار.
Protocol
- تألف جهاز يستخدم لاختبار الانتقال الضوء / الظلام من قفص (21x42x25 سم) مقسمة الى قسمين متساوية في الحجم من قبل قسم من الباب (أوهارا وشركاه ، طوكيو).
- إيواء الفئران 3-4 في القفص في غرفة مع دورة الضوء / الظلام 12 ساعة (أضواء على الساعة 7:00 صباحا) بالمال وبالشهرة أيضا مع وصول الفريق الى الغذاء والماء. من الناحية المثالية ، ويضم عنصري تحكم المسوخ واثنين معا ، من خلال إعادة تنظيم الفئران بمجرد genotyped أنهم في وقت الفطام. يتم إجراء اختبارات سلوكية 9:00 حتي 6:00 يتم نقل جميع الأقفاص التي تحتوي على الفئران لاختبار سلوك غرفة و 30 دقيقة قبل أن تبدأ المحاكمة الأولى.
- غير مضاءة الزاهية غرفة واحدة بواسطة الثنائيات البيضاء (390 لوكس) ، في حين أن الآخر هو الغرفة المظلمة (2 لوكس). يتم وضع الفئران في الجانب المظلم ، وفتحت الباب تلقائيا بعد 3 ثوان يتم الكشف عن الماوس بواسطة كاميرا الأشعة تحت الحمراء. ويستخدم الباب حتى أن الفئران لا تدخل في دائرة الضوء بعد الافراج فورا مع دوافعهم للهروب من مجرب ، ومنذ زمن لدخول غرفة الخفيفة التي قد تكون بمثابة مؤشر للقلق مثل السلوك.
- ويسمح للفئران على التحرك بحرية بين الغرفتين مع الباب مفتوحا لمدة 10 دقيقة. ويستند التطبيق المستخدم للحصول على البيانات وتحليلها السلوكية (صورة LD4) على برنامج الملك العام J صورة (byWayne Rasband المتقدمة في المعهد الوطني للصحة العقلية والمتاحة في http://rsb.info.nih.gov/ij /) ، الذي عدل من قبل Miyakawa تسويوشي (المتاحة من خلال اوهارا وشركاه ، طوكيو ، اليابان).
- المسافة المقطوعة في كل غرفة ، فإن العدد الإجمالي من التحولات ، والوقت الذي يقضيه في كل غرفة ، والكمون لدخول الضوء chamberare التي سجلتها برنامج LD4 صورة.
- بعد كل محاكمة ، ويتم تنظيف جميع الغرف تحت الكلور مع الماء لمنع السوبر تحيز على أساس العظة الشمية.
Discussion
على الرغم من أنه تم تحديد كل من تسلسل جينوم الفأر ، ليست معروفة وظائف معظم هذه الجينات. الجينات التي تستهدف التقنيات ، ومع ذلك ، يمكن أن تستخدم لحذف أو التعامل مع جين معين في الفئران (أيبا وآخرون ، 2007 ؛. أوستن وآخرون ، 2004). ويمكن بعد ذلك من تأثير جين معين على سلوك معين يتم تحديدها عن طريق إجراء التحاليل السلوكية للفئرانا معدلة وراثيا (تاكاو وMiyakawa ، 2006 ؛. تاكاو وآخرون ، 2007). كاختبار لphenotyping السلوكية للفئرانا معدلة وراثيا ، واختبار الانتقال الضوء / الظلام هي واحدة من أكثر الاختبارات المستخدمة على نطاق واسع لقياس القلق تشبه السلوك في الفئران (كراولي ، 2000). ويستند الاختبار على النفور من الفئران الطبيعية إلى مناطق مضيئة وبراقة على سلوكهم العفوي استكشافية في بيئات رواية (كراولي ، 1985). اختبار حساسة للعلاج بالعقاقير مزيل القلق (كراولي ، 1985). الجهاز يتكون من غرفة مظلمة وغرفة مضاءة الزاهية. وهناك فتحة المقيدة ، 3 سم ارتفاع بنسبة 5 سم ، يربط بين الغرفتين. ويسمح للفئران على التحرك بحرية بين الغرفتين. قضى عدد الإدخالات في غرفة مشرق ومدة من الزمن كما أن هناك مؤشرات على استخدام الفضاء مشرق القلق لدى الفئران.
وضعت أصلا لاختبار الانتقال الضوء / الظلام بواسطة كراولي وزملاء (كراولي وغودوين ، 1980). هناك نوعان من الفروق بين النسخة الأصلية واختبار لدينا. أولا ، ضوء الغرفة أكبر من الغرفة المظلمة في النسخة الأصلية ، في حين أن حجم الغرفتين هو نفسه في نسختنا من الاختبار. الثاني ، في النص الأصلي ، وكان ضوء الغرفة جود سقف وجدران الغرفة الضوء والشفافية (كراولي وغودوين ، 1980) ، في حين نستخدم بلاستيكية بيضاء شفافة لسقف وجدران الغرفة الخفيفة. هذه الاختلافات ، وهما حجم والانفتاح في ضوء الغرفة ، والسماح للكشف في وقت واحد مشرق في الفضاء القلق فضلا عن فتح الفضاء القلق في النسخة الأصلية للاختبار. في المختبر لدينا ، ومع ذلك ، وفتح الفضاء هو اختبار للقلق مثل السلوك في الفئران في المتاهة قيمة مضافة مرتفعة. الجدران والسقف مبهمة ، وحجم الغرفة الضوء ، ومحددة لدينا ضوء / اختبار الانتقال بروتوكول الظلام هو أكثر تخصصا لاكتشاف الفضاء مشرق القلق بالمقارنة مع النص الأصلي.
على الرغم من أن اختبار الانتقال الضوء / الظلام ومتاهة ارتفاع زائد على حد سواء المستخدمة لتقييم القلق مثل السلوك ، فإن النتائج ليست دائما متسقة. على سبيل المثال ، الدماغ الأمامي محددة الفئران خروج المغلوب الكالسينيورين (calcineurin) انخفض إنفاق مبلغ من الوقت في الغرفة ضوء في اختبار الانتقال الضوء / الظلام ، ولكن زيادة كمية من الوقت في بأذرع مفتوحة في متاهة زائد مرتفعة (Miyakawa وآخرون ، 2003) . افترضنا أن لدينا الضوء / الظلام والاختبارات اختبار الانتقال مرتفعة بالإضافة إلى متاهة تقييم جوانب مختلفة من القلق مثل السلوك ، مثل مشرق الفضاء القلق والفضاء المفتوح للقلق مثل السلوك. لاختبار هذه الفرضية ، استخدمنا بيانات تم جمعها باستخدام مجموعة كبيرة من الفئران نفسه في كل الاختبارات. في المختبر لدينا ، ونحن إجراء اختبار بطاريات السلوكية التي تغطي العديد من المجالات على الشاشة للحصول على أهمية الجينات السلوكية. البطارية اختبار يتطلب عدة أسابيع حتى يكتمل. أثناء فترة الاختبار ، يتم الاحتفاظ أقفاص الماوس على الرف في مصنعنا. إذا نقلت إلى الفئران المختبرية لدينا من المؤسسات الأخرى ، وأنهم اعتادوا على البيئة من منشأتنا لمدة لا تقل عن 1 في الاسبوع. بعد فترة التعود ، تتعرض الفئران لفحص الصحة العامة والعصبية الفرز (Miyakawa وآخرون ، 2003) ، وبعد هذه الامتحانات بسيطة ، يتعرض الفئران لاختبار الانتقال الضوء / الظلام. ويجرى الاختبار في غرفة إثبات الصوت التجريبي بعد 30 دقيقة من التعود إلى الغرفة التجريبية ، كما هو مبين في الفيلم.
لقد قمنا بتقييم أكثر من 60 سلالات من الفئران المعدلة وراثيا الطافرة باستخدام بروتوكول يظهر في الفيلم وجود مجموعة كبيرة من البيانات الخام لأكثر من 3000 الفئران (بما في ذلك نوع البرية وفئرانا معدلة وراثيا). أجرينا تحاليل معامل للاستفادة من مجموعة كبيرة من البيانات الخام. في الواقع ، اكتشفنا عوامل مختلفة من كل اختبار (بيانات غير منشورة) ، بالرغم من وجود ارتباط كبير بين بعض المؤشرات (بيانات غير منشورة).. وسيتم الكشف عن هذه البيانات كجزء من قاعدة بيانات عامة أن نقوم ببناء الآن.
في بطارية اختبار لدينا ، وتستخدم عادة من النوع البري تتزاحم كمجموعة تحكم. كما سلالة الخلفية ، ويشيع استخدام الفئران C57BL/6J. جمعنا البيانات من الفئران C57BL/6J تستخدم كعنصر تحكم من الفئران الطافرة في بطارية اختبار. وكانت المؤشرات التي تم الحصول عليها من الفئران في اختبار لدينا C57BL/6J انتقال الضوء / الظلام كما يلي (ن = 795 ؛ SEM الوسط) ؛ المسافة : 846.5 8.88 سم في ضوء الغرفة ، 1478.5 9.53 سم في غرفة مظلمة ؛ مدة من الوقت الذي يقضيه : 215.8 1.85 ليالي في ضوء ذلك ، ليالي 395.8 1.86 في الظلام ، وعدد من التحولات بين المقصورات : 30.52 0.43 ؛ الكمون لدخول غرفة ضوء : 64.94 2.40 ثانية. تم الكشف عن الحركة من الفئران حول مداخل الغرف بواسطة الكاميرا ويسجل والوقت الذي يقضيه في كل جhambers. وبسبب هذا ، أنفق هذا المبلغ لمدة من الوقت يعني في ضوء وذلك في حجرات مظلمة كان أكبر من ذلك لكامل مدة الاختبار (600 ق).
في بروتوكول لدينا ، وضعت لأول مرة الماوس في غرفة مظلمة. ثلاث ثوان بعد وضع الماوس في غرفة مظلمة ، والباب بين الغرفتين تفتح تلقائيا والفأر يستطيع التحرك بحرية بين الغرفتين. الفئران C57BL/6J يمضون وقتا أقل في غرفة من الضوء في الغرفة المظلمة (ع <0.0001 ، والمدة إذا كان الوقت الذي يقضيه في ضوء : 215.8 1.85 ثانية ، مدة من الوقت الذي يقضيه في الظلام : 316.3 2.11 ق [الوقت الذي يقضيه في الظلام لا لا تشمل الوقت الأولي قضى في الظلام قبل دخول غرفة الضوء للمرة الأولى] ، ن = 795 ، مقترن اختبار - T). هذا يشير إلى أن الفئران C57BL/6J تميل لتجنب ضوء الغرفة ، وبأن الوقت الذي يقضيه في ضوء هو مؤشر جيد للقلق مثل السلوك.
تتم مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بسهولة من سلالات مختلفة من الفئران الطافرة ، لأن الحصول على كافة البيانات باستخدام بروتوكول نفسه. للحصول على نتائج phenotyping سلالة من الفئران الطافرة التي يمكن أن تتكرر بسهولة وبالمقارنة مع بيانات المسوخ أخرى ، ينبغي أن تكون طرق الاختبار السلوكية متطابقة ممكن بين المختبرات. اختبار كراب والزملاء التفاعل بين السلوك والبيئة الماوس المختبر باستخدام بالضبط نفس السلالات الفطرية وسلالة واحدة متحولة فارغة. في دراستهم ، كانت أجهزة وبروتوكولات الاختبار ، وكثير من المتغيرات البيئية الموحدة بشكل صارم. على الرغم من التوحيد ، وجدوا اختلافات منهجية في السلوك عبر المختبرات ، وعلى الرغم من أنها اكتشفت سلالة أيضا اختلافات في جميع السلوكيات (كراب وآخرون ، 1999). وذكرت ان المتغيرات لا يمكن السيطرة عليها والتجارب التي تميز المسوخ قد تسفر عن النتائج التي يتم الفقهي الى مختبر خاص. الاختلافات الإجرائية التي توجد بين مختبرات تجعل من الصعب تكرار أو مقارنة بين نتائج المختبرات. هنا ، ونحن لدينا بروتوكول الحالي لاختبار الانتقال الضوء / الظلام كفيلم بحيث يمكن البرهنة على تفاصيل البروتوكول.
ووضع وثائق بصرية للبروتوكول تسهيل فهم أفضل لتفاصيل الإجراءات التجريبية ، والسماح لتوحيد البروتوكولات المستخدمة في المختبرات وإجراء مقارنات من الظواهر السلوكية للسلالات مختلفة من الفئران الطافرة المقررة باستخدام هذا الاختبار. حاليا الأفلام من البروتوكولات الأخرى ، مثل المتاهة زائد مرتفعة ، فتح الاختبار الميداني ، porsolt اختبار السباحة القسري ، وتكييف الخوف ، والتي نستخدمها في بطارية اختبار لدينا السلوكية التي تبذل من أجل نشر والمستقبل مقالات مجلة الفيديو.
Disclosures
وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في استخدام الحيوان والعناية اللجنة من جامعة كيوتو. ويرتبط تسويوشي Miyakawa مع الطيور والعلوم والتكنولوجيا وكالة اليابان ، سايتاما ، اليابان.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من خلال المنح التي تقدم للمساعدة للعلماء الشباب (A) (# 16680015) ، منحة في والمعونة للبحوث الاستكشافية (# 16653065) ، منحة في والمساعدات للأبحاث العلمية في المجالات ذات الأولوية (# 18023022 # 18016012 18053015 و#) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان ، والمنح التي تقدم للمساعدة من تعزيز الدراسات الأساسية في العلوم الصحية التابع للمعهد الوطني للابتكار الطبية الحيوية (NIBIO) ، في والمنح مساعدات من اليابان Neuroinformatics مركز (NIJC) ، بتبريد
References
- Austin, C. P. The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley & Sons. (2000).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci Biobehav Rev. 9, 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav. 13, 167-1670 (1980).
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-162 (1999).
