Summary
המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט שמראה נהלים מפורט על איך אנו עורכים את הבדיקה.
Abstract
למרות כל רצפי גנום העכבר נקבעו, אנחנו עדיין לא יודעים את הפונקציות של רוב הגנים האלה. ג'ין במיקוד טכניקות, לעומת זאת, יכול לשמש כדי למחוק או לשנות גן מסוים בעכברים. השפעתו של גן מסוים על התנהגות ספציפית אז יכול להיות נקבע על ידי ביצוע ניתוח התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה. כמבחן עבור phenotyping התנהגותיים של עכברים שעברו מוטציה, המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. הבדיקה מבוססת על שנאת הטבעי של העכברים לאזורים המואר על התנהגות גישוש ספונטנית שלהם בסביבות רומן. המבחן הוא רגיש טיפול תרופתי לטיפול בחרדות. מנגנון מורכב חדר חושך וחדר מואר. עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. מספר רשומות לתוך תא בהיר את משך הזמן המושקע ישנם מדדים של חרדה בהיר מרחב בעכברים. כדי להשיג תוצאות phenotyping זן של עכברים מוטנטים שניתן לשכפל בקלות בהשוואה לאלו של מוטנטים אחרים, שיטות בדיקה התנהגותית צריך להיות זהה ככל האפשר בין המעבדות. ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות, לעומת זאת, מקשה לשכפל או ולהשוות את התוצאות בין המעבדות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלנו למבחן אור / חושך המעבר כסרט כך את הפרטים של פרוטוקול ניתן להדגים. במעבדה שלנו, יש לנו להעריך יותר מ -60 זנים של עכברים מוטנטים באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט. נתונים אלה יחשף כחלק מסד נתונים ציבורי שעכשיו אנחנו בונים.
ויזואליזציה של פרוטוקול תאפשר הבנה של פרטי הליך הניסוי כולו, המאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשתמש בה בכל מעבדות השוואות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקה זו.
Protocol
- המנגנון המשמש מבחן אור / חושך המעבר כללה בכלוב (21x42x25 ס"מ) מחולק לשני חלקים בגודל שווה על ידי מחיצה עם דלת (אוהרה ושות', טוקיו).
- עכברים הם שוכנו 03:57 לכל כלוב בחדר עם מחזור אור / חושך 12 לשעה (אורות בשעה 07:00) עם גישה כרצונך מודעה מזון ומים. באופן אידיאלי, שני פקדים שני מוטנטים הם שוכנו יחד, על ידי ארגון מחדש עכברים ברגע שהם genotyped בזמן הגמילה. הבדיקה מבוצעת ההתנהגות 9:00-18:00 כל הכלובים המכיל עכברים מועברים לחדר בדיקות התנהגות 30 דקות לפני המשפט הראשון מתחיל.
- אחת קאמרית הוא מואר על ידי דיודות לבן (390 לוקס), ואילו החדר השני חשוך (2 lux). עכברים ממוקמות אל הצד האפל, והדלת נפתחה באופן אוטומטי לאחר 3 שניות את העכבר הוא זוהה על ידי מצלמת אינפרא אדום. הדלת משמשת כך העכברים לא להיכנס לחדר אור מיד לאחר שחרורו עם המוטיווציה שלהם לברוח הנסיין, מכיוון חביון להיכנס לחדר האור יכול לשמש כמדד להתנהגות חרדה וכדומה.
- עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני חדרים עם דלת פתוחה 10 דקות. היישום משמש עבור רכישת וניתוח נתונים התנהגותיים (תמונה LD4) מבוססת על תוכנית J הציבור תמונה תחום (שפותחה byWayne Rasband במכון הלאומי לבריאות הנפש וזמין בכל http://rsb.info.nih.gov/ij /), אשר שונה על ידי Tsuyoshi Miyakawa (זמין באמצעות אוהרה ושות', טוקיו, יפן).
- המרחק נסעו בתא אחד, המספר הכולל של מעברים, משך הזמן בחדר אחד, ואת חביון להיכנס chamberare אור נרשם על ידי תוכנית תמונה LD4.
- אחרי כל משפט, כל החדרים מנקים עם מים hypochlorous סופר כדי למנוע הטיה על בסיס רמזים חוש הריח.
Discussion
למרות כל רצפי גנום העכבר נקבעו, פונקציות של רוב הגנים הללו אינם ידועים. ג'ין במיקוד טכניקות, לעומת זאת, יכול לשמש כדי למחוק או לשנות גן מסוים בעכברים (Aiba et al, 2007;. אוסטין et al, 2004).. השפעתו של גן מסוים על התנהגות ספציפית אז יכול להיות נקבע על ידי ביצוע ניתוח התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה (טאקאו ו Miyakawa, 2006;. טאקאו et al, 2007). כמבחן עבור phenotyping התנהגותיים של עכברים שעברו מוטציה, המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים (קרולי, 2000). הבדיקה מבוססת על שנאת הטבעי של העכברים לאזורים המואר על התנהגות גישוש ספונטנית שלהם בסביבות רומן (קרולי, 1985). המבחן הוא רגיש טיפול תרופתי לטיפול בחרדות (קרולי, 1985). מנגנון מורכב חדר חושך וחדר מואר. פתיחה מוגבלת, 3 ס"מ על 5 ס"מ, המחברת בין שני החדרים. עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. מספר רשומות לתוך תא בהיר את משך הזמן המושקע שם משמשים מדדי חרדה בהיר מרחב בעכברים.
המבחן אור / חושך מעבר פותחה במקור על ידי קרולי ועמיתיו (קרולי גודווין, 1980). ישנם שני הבדלים בין הגירסה המקורית שלהם במבחן שלנו. ראשית, תא אור גדול יותר חדר חושך בגרסה המקורית, ואילו את הגודל של שני חדרים הוא אותו בגרסה שלנו הבדיקה. שנית, בגרסה המקורית, את החדר באור לא התקרה ועל הקירות של החדר באור היו שקופים (קרולי גודווין, 1980), בעוד אנו משתמשים פלסטיק לבן אטום על התקרה והקירות של החדר באור. הבדלים אלו, כלומר את גודל ופתיחות של החדר אור, לאפשר זיהוי סימולטני של חרדה בהיר בחלל, כמו גם שטח פתוח חרדה בגרסה המקורית של המבחן. במעבדה שלנו, לעומת זאת, שטח פתוח חרדה כמו התנהגות בעכברים נבדק במבוך פלוס גבוהות. קירות אטומים התקרה, גודל החדר אור, אור הספציפי שלנו / פרוטוקול כהה מבחן המעבר מתמחה יותר לאיתור בהיר מרחב חרדה לעומת הגירסה המקורית.
למרות המבחן אור / חושך המעבר במבוך גבוהות פלוס הן בשימוש להערכת חרדה כמו התנהגות, התוצאות הן לא תמיד עקבית. לדוגמה, forebrain ספציפיים בעכברים calcineurin בנוקאאוט להוציא סכום קטן של זמן בחדר אור במבחן אור / חושך המעבר, אך כמות מוגברת של זמן בזרועות פתוחות במבוך פלוס גבוהות (Miyakawa et al., 2003) . החוקרים שיערו כי האור שלנו / מבחן מעבר כהה בדיקות גבוהות פלוס מבוך להעריך אספקטים שונים של התנהגות, כמו חרדה, כגון חרדה בהיר מרחב פתוח בחלל חרדה כמו התנהגות. כדי לבחון סברה זו, היינו נתונים גדול שנאסף להגדיר באמצעות עכברים באותו בדיקות שניהם. במעבדה שלנו, אנו עורכים סוללות מבחן התנהגותי מכסה תחומים רבים למסך את המשמעות התנהגותיים של גנים. הסוללה הבדיקה דורשת מספר שבועות כדי להשלים. במהלך תקופת הבדיקה, כלובים עכבר נשמרים על מדף במתקן שלנו. אם עכברים מועברים במעבדה שלנו ממוסדות אחרים, הם מורגלים לסביבה של המתקן שלנו במשך שבוע לפחות 1. לאחר תקופת התרגלות, עכברים כפופים לבדיקה בריאות כללית ההקרנה נוירולוגית (Miyakawa et al. 2003), ואחרי בדיקות פשוטות אלה, עכברים כפופים מבחן אור / חושך המעבר. הבדיקה מתבצעת בחדר קול הוכחה ניסויית לאחר 30 דקות של התרגלות לחדר ניסיוני, כפי שמוצג בסרט.
יש לנו להעריך יותר מ -60 זנים של עכברים מהונדסים גנטית מוטציה באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט יש קבוצה גדולה של נתונים גולמיים עבור יותר מ 3000 עכברים (כולל wild-type ועכברים שעברו מוטציה). ערכנו ניתוחים גורם לנצל להגדיר את גדולה של נתונים גולמיים. ואכן, זיהינו גורמים שונים כל בדיקה (נתונים שלא פורסמו), אם כי היו כמה מתאמים משמעותיים בין מדדי (נתונים שלא פורסמו) .. נתונים אלה יחשף כחלק מסד נתונים ציבורי שעכשיו אנחנו בונים.
בשנת סוללה הבדיקה שלנו, wild-type להמלטה משמשים בדרך כלל כביקורת. כמו זן רקע, עכברים C57BL/6J משמשים בדרך כלל. אספנו את הנתונים של עכברים C57BL/6J לשמש מלאה של עכברים מוטנטים סוללה הבדיקה. המדדים המתקבלים עכברים C57BL/6J במבחן שלנו אור / חושך המעבר היו כדלקמן (n = 795; SEM אומר); המרחק: 846.5 8.88 ס"מ בחדר אור, 1478.5 9.53 ס"מ בחדר חשוך, משך הזמן המושקע : 215.8 1.85 s לאור, 395.8 1.86 s בחושך; מספר מעברים בין תאים: 30.52 0.43; חביון להיכנס לחדר אור: 64.94 2.40 ש ' התנועה של עכברים סביב הכניסות לתאי מזוהה על ידי המצלמה נחשבת הזמן המושקע הן גhambers. בגלל זה, סכום ממוצע של משך הזמן המושקע לאור וכי תאים כהה היה גדול יותר מזה של כל תקופת הבדיקה (600 י).
בפרוטוקול שלנו, עכבר הוא במקום הראשון בחדר חשוך. שלוש שניות לאחר הצבת העכבר בחדר חשוך, את הדלת בין החדרים באופן אוטומטי נפתח העכבר יכולים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. עכברים C57BL/6J להשקיע פחות זמן בחדר אור מאשר בחדר חשוך (p <0.0001, אם משך הזמן המושקע לאור: 215.8 1.85 שניות, משך הזמן המושקע בחושך: 316.3 2.11 s [את הזמן בחושך עושה לא כולל את פרק הזמן הראשוני ביליתי בחושך לפני הכניסה לתא אור בפעם הראשונה], n = 795, לזווג-t מבחן). זה מעיד כי עכברים C57BL/6J נוטים להימנע תא האור, כי משך הזמן לאור היא מדד טוב של התנהגות, כמו חרדה.
התוצאות שהתקבלו זנים שונים של עכברים מוטנטים מושווים בקלות, כי כל הנתונים מתקבלים באמצעות פרוטוקול זהה. כדי להשיג תוצאות phenotyping זן של עכברים מוטנטים שניתן לשחזרו בקלות, לעומת הנתונים של מוטנטים אחרים, שיטות בדיקה התנהגותית צריך להיות זהה ככל האפשר בין המעבדות. קראב ועמיתיו בדקו את האינטראקציה בין התנהגות העכבר באמצעות סביבת מעבדה בדיוק זנים טהורים באותו זן אחד מוטנטי null. במחקר שלהם, את המנגנון, פרוטוקולי הבדיקה, משתנים סביבתיים רבים היו סטנדרטיים בקפדנות. למרות הסטנדרטיזציה, הם מצאו הבדלים שיטתיים בהתנהגות מול מעבדות, למרות שהם גם זוהה זן הבדלים בכל התנהגויות (קראב et al., 1999). הם דיווחו כי משתנים בלתי נשלט וניסויים ואפיון מוטנטים עשוי להניב תוצאות שאינן ייחודי למעבדה מסוימת. ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות להקשות לשכפל או ולהשוות את התוצאות בין המעבדות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלנו למבחן אור / חושך המעבר כסרט כך את הפרטים של פרוטוקול ניתן להדגים.
הקמת תיעוד חזותי של הפרוטוקול יאפשר הבנה טובה יותר של הפרטים של הפרוצדורות, המאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשתמש בה בכל מעבדות להשוואות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקה זו. סרטים של פרוטוקולים אחרים, כגון עבור במבוך פלוס גבוהות הבדיקה, שדה פתוח, מבחן porsolt נאלץ לשחות, מיזוג פחד, כי אנו משתמשים בסוללה מבחן ההתנהגות שלנו כרגע נעשים לפרסום כמו מאמרים בעתיד וידאו.
Disclosures
כל ההליכים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים ועדת Care מאוניברסיטת קיוטו. Tsuyoshi Miyakawa קשורה בירד, יפן המדע והטכנולוגיה הסוכנות, סאיטמה, יפן.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים-in-Aid למדענים צעירים (א) (# 16680015), גרנט-in-Aid למחקר גישוש (# 16653065), גרנט-in-Aid למחקר מדעי על אזורי עדיפות (# 18023022, # ו # 18016012 18053015) מטעם משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, הטכנולוגיה ביפן, גרנט-in-Aid מן קידום ללימודי יסוד למדעי הבריאות של המכון הלאומי של חדשנות ביו (NIBIO), גרנט ב- סיוע מן Neuroinformatics יפן מרכז (NIJC), RIKEN
References
- Austin, C. P. The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley & Sons. (2000).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci Biobehav Rev. 9, 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav. 13, 167-1670 (1980).
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-162 (1999).
