Summary
어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.
Abstract
마우스 게놈 시퀀스의 모든 결정했지만, 아직이 유전자의 대부분의 기능을 모르겠어요. 유전자는 타겟팅 기법을하지만, 마우스에서 특정 유전자를 삭제하거나 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 다음 돌연변이 생쥐의 행동 분석을 실시하여 결정하실 수 있습니다. 돌연변이 생쥐의 행동 phenotyping을위한 시험으로, 어둠 / 불빛 전이 검사는 생쥐의 행동과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 시험은 밝게 조명 영역에 생쥐의 자연 혐오감과 소설 환경에서 자연 탐험 행동을 기반으로합니다. 시험은 anxiolytic 약물 치료에 민감합니다. 장치는 어두운 챔버와 밝은 조명 챔버로 구성되어 있습니다. 생쥐 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 밝은 챔버에 항목과 시간의 기간의 숫자는 생쥐에 밝은 공간 불안의 인덱스가있다 보냈다. 쉽게 재현과 다른 돌연변이의 기능과 비교할 수 있습니다 돌연변이 생쥐의 변형의 결과를 얻으려면 phenotyping, 행동 테스트 방법은 실험실 간의 가능한 동일해야합니다. 실험실 사이에 존재하는 절차적 차이점은, 그러나, 어려운 실험실 간의 결과를 복제하거나 비교합니다. 여기에서 우리는 프로토콜의 세부 사항을 증명 할 수 있도록 동영상으로 어둠 / 빛으로 전환 테스트를위한 프로토콜을 제시한다. 저희 연구실에서는, 우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 돌연변이 생쥐의 60 개 이상 변종을 평가했습니다. 이러한 데이터는 지금 우리가 건설하는 공공 데이터베이스의 일부로 공개되지 않습니다.
프로토콜의 시각화는 실험실과 돌연변이 생쥐의 다양한 변종의 행동 phenotypes의 비교에서 사용 프로토콜의 표준화에 대한 허용, 전체 실험 절차의 세부 사항의 이해를 촉진이 테스트를 사용하여 평가됩니다.
Protocol
- 어둠 / 빛으로 전환 테스트에 사용되는 장치는 문이있는 파티션 (오하라 & (주), 도쿄)에서 동일한 크기의 두 부분으로 나누어 케이지 (21x42x25 cm)로 구성되어.
- 마우스는 음식과 물이 광고 libitum 접속 12 시간 라이트 / 어두운주기 (오전 7시 불을)와 한 방에 케이지 당 3-4 거주하고 있습니다. 이상적으로, 두 컨트롤 두 돌연변이 바로 그들이 이유 시에 genotyped 그대로 생쥐를 다시 구성하여 함께 위치해있다. 행동 검사는 오전 9시 사이에 수행하고 첫 번째 재판이 시작되기 전에 마우스를 포함한 모든 연습장이 동작 테스트 룸으로 30 분 전송됩니다 PM 6시입니다.
- 다른 챔버 (2 룩스) 어두운 반면 하나의 챔버는 밝은, 백색 다이오드 (390 룩스)의 조명입니다. 생쥐는 어둠의 세력에 배치하고 마우스가 적외선 카메라 감지 후 문이 자동으로 삼초를 개설합니다. 문이 빛을 챔버를 입력 지연이 불안과 같은 행동의 인덱스 역할을 수 있기 때문에 마우스가 실험자에서 탈출하기 위해 동기와 함께 출시 직후 빛을 챔버를 입력하지 않도록하는 데 사용됩니다.
- 생쥐 10 분 개방과 함께 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 행동 데이터 (이미지 LD4)를 취득하고 분석에 사용되는 응용 프로그램은 공개 도메인 이미지 J 프로그램 (정신 건강의 국립 연구소 byWayne Rasband을 개발하고 http://rsb.info.nih.gov/ij에서 구할 수를 기반으로 츠요시 미야 카와 (오하라 & (주), 일본 도쿄를 통해 제공되는)로 바뀌었습니다 /).
- 거리는 각각의 챔버에서 여행 전환의 총 개수는 시간은 각 챔버의 소비, 이미지 LD4 프로그램에 의해 기록된 조명 chamberare를 입력 대기.
- 각각의 시험 후, 모든 여왕님 후각 단서에 따라 편견을 방지하기 위해 슈퍼 hypochlorous 물로 세척합니다.
Discussion
마우스 게놈 시퀀스의 모든 결정되었습니다 있지만, 이러한 유전자의 대부분의 기능은 알려져 있지 않습니다. 유전자는 타겟팅 기법을하지만, 마우스의 특정 유전자 (.; 오스틴 외, 2004. 아이바 외, 2007) 삭제하거나 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 다음 돌연변이 생쥐의 행동 분석을 (.; 타카오 외, 2007 타카오와 미야 카와, 2006) 실시에 의해 결정하실 수 있습니다. 돌연변이 생쥐의 행동 phenotyping을위한 시험으로, 어둠 / 불빛 전이 검사는 생쥐의 행동 (크롤리, 2000)와 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 시험은 밝게 조명 영역에 생쥐의 자연 혐오감과 소설 환경에서 자연 탐험 행동 (크롤리, 1985)을 기반으로합니다. 시험은 anxiolytic 약물 치료 (크롤리, 1985)에 민감합니다. 장치는 어두운 챔버와 밝은 조명 챔버로 구성되어 있습니다. 5cm 너비로 3cm 높이 제한 개방은 두 방을 연결합니다. 생쥐 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 밝은 챔버에 항목과 시간의 기간의 숫자는 생쥐에 밝은 공간 불안 지수가 거기에 사용됩니다 보냈다.
어둠 / 빛으로 전환 시험은 원래 크롤리와 동료 (크롤리와 굿윈, 1980)에 의해 개발되었습니다. 자신의 원래 버전 및 테스트 사이를 둘 다 차이가 있습니다. 두 챔버의 크기가 시험 우리의 버전에서 동일한 반면 첫째, 조명 챔버는 원래 버전의 어두운 챔버보다 큽니다. 둘째, 원래 버전에서 빛이 챔버는 천정에 없었다 우리가 빛을 챔버의 천장과 벽면에 대한 불투명 흰색 플라스틱을 사용하면서 조명 챔버의 성벽 (크롤리와 굿윈, 1980) 투명했다. 즉 이러한 차이, 빛의 챔버의 크기와 개방은 동시 밝은 공간 불안의 탐지뿐만 아니라 시험의 원래 버전에서 오픈 스페이스에 대한 불안감 수 있습니다. 저희 연구실에서는, 그러나, 오픈 스페이스 생쥐의 행동과 같은 불안이 높은 플러스 미로에서 테스트됩니다. 불투명 벽, 천정, 조명 챔버의 크기, 그리고 구체적인 가벼운 / 어두운 전환 테스트 프로토콜의 원래 버전에 비해 밝은 공간 불안 검출에 대한 더 전문입니다.
어둠 / 빛으로 전환 테스트 및 고가 플러스 미로 모두 행동과 같은 불안을 평가에 사용되고 있지만, 결과는 항상 일관성이 없습니다. 예를 들어, forebrain 특정 calcineurin의 녹아웃 마우스는 어둠 / 빛으로 전환 시험에서 조명 챔버의 시간의 감소 금액을 지출하지만, 고가 플러스 미로에서 쌍수를 시간의 증가 금액 (미야 카와 외., 2003) . 우리는 우리의 빛 / 어둠 전이 테스트 및 고가 플러스 미로 테스트 같은 밝은 공간 불안과 개방 공간 불안과 같은 행동으로 불안과 같은 행동의 다양한 측면을 평가하는 것이 가상. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 큰 데이터를 모두 테스트에서 동일한 생쥐를 사용하여 수집된 세트를 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 유전자의 행동 중요성에 대한 화면으로 여러 도메인을 다루는 행동 테스트 배터리를 실시합니다. 테스트 배터리는 몇 주를 완료해야합니다. 테스트 기간 동안, 마우스 케이지는 우리 시설에 선반에 보관됩니다. 생쥐가 다른 기관에서 우리 실험실로 운반하는 경우, 그들은 적어도 1 주일 우리 시설의 환경에 길들여지지하고 있습니다. 요법 이니 기간 후, 마우스는 일반 건강 진단 및 neurologic 심사 (미야 카와 외., 2003)를 받게되며, 다음의 간단한 시험 후, 생쥐는 어둠 / 빛으로 전환 테스트를 받게됩니다. 영화 같이 시험, 실험 방에 요법 이니, 30 분 후 사운드 증명 실험 실에서 실시됩니다.
우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 유전자 조작 돌연변이 생쥐의 60 개 이상 변종을 평가하고보다 3000 마우스 (야생 - 타입과 돌연변이 생쥐 포함)에 대한 원시 데이터의 큰 세트를 가지고있다. 우리는 원시 데이터의 큰 집합을 활용 요소 분석을 실시했다. 색인 (게시되지 않은 데이터) 사이에 중요한 상관 관계가 있었지만 실제로, 우리는 각 테스트 (게시되지 않은 데이터) 다른 요소를 감지 ... 이러한 데이터는 지금 우리가 건설하는 공공 데이터베이스의 일부로 공개되지 않습니다.
우리의 테스트 배터리에 야생 형 littermates은 일반적으로 컨트롤로 사용됩니다. 배경 스트레인으로 C57BL/6J 마우스는 일반적으로 사용됩니다. 우리는 시험 배터리의 돌연변이 쥐를의 제어로 사용 C57BL/6J 마우스의 데이터를 수집. 다음과 같이 우리의 어두운 / 라이트 전이 시험 C57BL/6J 마우스에서 얻은 색인 있었다 (n은 = 795이; 의미 SEM), 거리 여행 : 조명 챔버의 846.5 8.88 cm, 어두운 실내에서 1478.5 9.53 cm, 시간의 기간 동안 : 빛 가운데 215.8 1.85 S, 어둠 속에서 395.8 1.86들, 구획 사이의 전환의 개수 : 30.52 0.43; 빛을 챔버를 입력 대기 시간 : 64.94 2.40 S. 방으로 입구 주변 생쥐의 움직임은 카메라에 의해 감지와 C 모두에서 보낸 시간으로 계산됩니다hambers. 이 때문에, 시간의 의미 기간의 합계가 빛 가운데 지출과 어두운 구획의 테스트 (600 S)의 전체 기간의보다 큰 것을.
우리의 프로토콜에서는, 마우스는 처음 어두운 챔버에 배치됩니다. 세 초 어둠 챔버에 마우스를 배치 후 챔버 사이의 문이 자동으로 열리고 마우스 두 실 사이를 자유롭게 이동할 수 있습니다. 215.8 1.85 초, 어둠 속에서 보낸 시간 소요 시간 : 316.3 2.11 S [시간 어둠 속에 보냈다 않습니다 C57BL/6J 마우스가 (P <0.0001, 기간 시간이 조명에 보낸 경우 어두운 챔버에 비해 빛의 챔버에 적은 시간을 보내고 처음으로 빛을 챔버], N = 795, 이점 - T 테스트)를 입력하기 전에 어둠 속에서 보낸 초기 시간을 포함하지 않습니다. 이것은 C57BL/6J 마우스가 빛을 챔버를 방지하는 경향을 나타냅니다, 그리고 빛 속에서 보낸 시간이 불안과 같은 행동을 좋은 인덱스입니다.
모든 데이터가 같은 프로토콜을 사용하여 얻은 돌연변이 때문에 마우스의 다양한 변종에서 얻은 결과는 쉽게 비교됩니다. 쉽게 재현 및 기타 돌연변이의 데이터와 비교할 수 있습니다 돌연변이 생쥐의 변형의 결과를 얻으려면 phenotyping, 행동 테스트 방법은 실험실 간의 가능한 동일해야합니다. 크래브 및 동료 정확히 같은 근친 변종 하나의 NULL 돌연변이 변종을 사용하여 마우스 동작 및 실습 환경 사이의 상호 작용을 테스트했습니다. 그들의 연구에서, 장치, 시험 프로토콜 및 여러 환경 변수를 엄격하게 표준화되었다. 그들은 또한 모든 동작 (크래브 외., 1999)의 변형의 차이를 감지하지만, 표준화에도 불구하고 그들은 실험실에 걸쳐 행동의 체계적인 차이를 발견했습니다. 그들은 돌연변이를 특성화 통제 변수와 실험 특정 실험실에 사안별로 다르며, 결과를 얻을 수 있습니다 보도했다. 실험실 사이에 존재하는 절차적 차이점은 어려운 실험실 간의 결과를 복제하거나 비교합니다. 여기에서 우리는 프로토콜의 세부 사항을 증명 할 수 있도록 동영상으로 어둠 / 빛으로 전환 테스트를위한 프로토콜을 제시한다.
프로토콜의 시각 설명서를 구축하는 것은 실험실 걸쳐 돌연변이 생쥐의 다양한 변종의 행동 phenotypes의 비교에 사용되는 프로토콜의 표준화를위한 수 있도록 실험 절차의 세부 사항의 이해를 촉진이 테스트를 사용하여 평가됩니다. 이러한 우리의 행동 테스트 전지에서 사용하는 고가 플러스 미로, 오픈 필드 테스트 porsolt 강제 수영 검사, 공포 컨디셔닝을 위해 다른 프로토콜의 동영상은 현재 미래의 비디오 저널 기사로 게시를 위해 만들어지고 있습니다.
Disclosures
모든 절차가 교토 대학의 동물 사용 및 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 츠요시 미야 카와는 새, 일본의 과학 기술 기관, 사이 타마, 일본과 관련된 것입니다.
Acknowledgments
이 연구에 의해 지원되었다 기금 - - 에이드의 젊은 과학자 탐험 연구 (A) (# 16680015), 보조금 (# 16653065), 우선 분야에 대한 학술 연구를위한 보조금 (# 18023022를위한 # 교육부, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술, 그랜트 - - 에이드의 바이오 메디컬 혁신의 국립 연구소 (NIBIO)의 건강 과학 기초 연구의 추진에서 그랜트 -에 -에서 18016012와 # 18053015) Neuroinformatics 일본 센터 (NIJC), RIKEN에서 원조
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