Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية توليد كهربائية من الألياف الكربونية. تستخدم لاحقا لكشف الأقطاب الافراج الكاتيكولامينات من الحويصلات مع amperometry ألياف الكربون.
Abstract
أقطاب من ألياف الكربون ذات أهمية حاسمة للكشف عن الافراج الكاتيكولامينات من الحويصلات في الخلايا واحد للقياسات amperometry. هنا ، نحن تصف التقنيات اللازمة لتوليد ضوضاء منخفضة (<0.5 سنويا) الأقطاب الكهربائية. تم تعديل التقنيات من الأوصاف التي نشرها الباحثون السابقة (1،2). أقطاب كهربائية مصنوعة من خلال إعداد ألياف الكربون والترابط بشكل فردي في كل أنبوب شعري باستخدام فراغ مع فلتر لنضح الألياف. المقبل ، ويتم سحب الأنبوب الشعري ، مع الألياف عن طريق مجتذب الكهربائي ، وخلق نصفين ، مع كل طرف غرامة مدببة. وتراجع الأقطاب في الايبوكسي ، والساخنة السائل مختلطة مع تصليب لإنشاء ختم الايبوكسي من الزجاج. أخيرا ، يتم وضع الأقطاب الكهربائية في الفرن لعلاج الايبوكسي. معالجة متأنية لأقطاب أمر بالغ الأهمية لضمان انها مصنوعة باستمرار ودون أضرار. هذا البروتوكول يوضح كيفية تلفيق وقطع كهربائية amperometric لتسجيل واحدة من الخلايا.
Protocol
الجزء 1 : تحضير الألياف الكربونية
- قطعت مجموعة من ألياف الكربون (التي نستخدمها 7μm القطر) في طول هذا هو ~ 1.25 X طول ماصة شعري.
- إزالة التحجيم من الغليان ~ 100 مل من الاسيتون في وعاء وإضافة الألياف إلى الأسيتون الحار المغلي لمدة 30 دقيقة أو أطول.
- إزالة الألياف من الأسيتون الدافئة ، ونقل إلى دورق نظيفة مع 5-10 مل من الاسيتون الطازجة.
- الألياف الجافة عن طريق وضع ربطة على فتح 150 مم طبق بتري وبين عشية وضحاها airdry.
الجزء 2 : أنابيب الزجاج الحريق تلميع شعرية
- النار تلميع كل الأنابيب الشعرية (التي نستخدمها الدقيقة الهيماتوكريت أنابيب الشعرية ، وقطره الخارجي 1.5mm ، 1.3mm قطرها الداخلي ، 7.5cm طويلة) من خلال عقد الأنبوب في مركز بالملقط وفضح النهاية الى flame.Rotate الأنبوب حوالي 3 مرات في حين أنه في اللهب.
- عكس الأنبوب ووضع الطرف المقابل في اللهب ، بالتناوب مرة 3 مرات.
- وضع أنابيب النار مصقول في طبق زجاج ونقل الى الفرن حتى تكون جاهزة لتكون مليئة ألياف الكربون.
الجزء 3 : خيوط من ألياف الكربون في أنبوب شعري
- مشابهة للأوصاف التي ماتشادو وآخرون. (2008) وMundroff وايتمان (2002) ، تمتص الألياف في أنبوب زجاجي باستخدام أنابيب بلاستيكية متصلة فراغ مع فلتر.
- قطع الألياف باستخدام scalpel.Leave ¼ بوصة من الألياف خارج الأنبوب.
الجزء 4 : سحب الألياف الماصة في بولير الكهربائي
- مكان الأنابيب الشعرية في القطب مجتذب (نستخدم Narishige اليابان النموذجي PP - 830) ، وتشديد المقابض لعقد أنبوب شعري في مكان.
- التعامل مع مفاتيح لتنفيذ two تسحب ، وضعت في الإعدادات مجتذب الأمثل.
- مرة واحدة يتم سحبها ماصة في نصف فصل شطري بقطع الألياف العارية في المركز باستخدام المقص.
- إزالة كل نصف القطب والجذب على الألياف جاحظ لكسر زجاج الألياف seal.Trim بالمقص بحيث لم يبق سوى 1 / 8 بوصة من الألياف خارج الأنبوب.
- كرر الخطوات 1-4 حتى يتم سحب نحو 16 الألياف الأقطاب.
الجزء 5 : جعل إبوكسي زجاج الختم
- الحرارة قسامة مسبقة الصنع من الايبوكسي على طبق ساخن تعيين إلى 55 درجة مئوية لمدة 6 دقائق في غطاء الدخان.
- بينما الايبوكسي والتدفئة ، والتفاف ~ 16 من أقطاب سحبت في حزمة باستخدام الشريط.
- بعد يتم تسخين الراتنج EPON لمدة 6 دقائق ، إضافة 0.7 جرام XOF MPDA إلى الراتنج EPON الساخنة (14 ٪ ، ث / ت). ميكس التي تدور القنينة.
- تراجع حزمة من الأقطاب الكهربائية في الايبوكسي الساخنة بالإضافة إلى تصليب solution.After حوالي 20 ثانية ، وهي كمية كافية من الايبوكسي ستدخل نصائح عبر الزجاج عمل شعري.
- تعيين الأقطاب التراجع حزمة مكان ، على الورق المقوى مع فتحات ومكان هذا الدرج في الفرن إلى 100 ° F.
- بعد 48 ساعة على الأقل ، ودراسة كل قطب كهربائي تحت microscope.Discard تشريح التي لم تمتلئ الايبوكسي ، وقد حطموا تلميح ، لديك أكثر من الألياف ، لتفتيش كل etc.After الكهربائي ، ووضعها مرة أخرى على حامل من الورق المقوى والظهر في oven.Electrodes وعادة ما تكون جيدة لحوالي 1 في الشهر بعد التصنيع.
الجزء 6 : قطع ألياف الكربون
- مكان ألياف الكربون القطب بعناية على شريحة زجاجية مع تفلون الشريط.
- تصور الطرف تشريح تحت المجهر.
- استخدام شفرة نظيفة مشرط لقطع عموديا عبر الألياف الكربونية لمغادرة سطح مستو نظيفة لتنسيب من ألياف الكربون ضد خلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يصف كيفية توليد كهربائية وقطع amperometric. خلال التسجيلات amperometric ، يتم وضع قطب كهربائي من ألياف الكربون على سطح الخلايا الإفرازية. وقد لوحظ نشاط Exocytotic والتموج amperometric ، مما يدل على الكهروكيميائية الحالية الناجمة عن نقل الإلكترونات بعد أكسدة الكاتيكولامينات. مع الممارسة القرارات وقطع كهربائية amperometric ، يمكن تحسين مستويات الضوضاء إلى حد كبير على كثير من الأقطاب الكهربائية متاحة تجاريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور آرون P. فوكس في جامعة شيكاغو ، في المختبر الذي كان مصمما أصلا هذا البروتوكول ، وليم رودن (جامعة سانت لويس) لمزيد من تطوير بروتوكول
نشكر مؤسسة ايتهول والمؤسسة الوطنية للعلوم للحصول على الدعم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
