Summary
このプロトコルは、炭素繊維電極を生成する方法について説明します。電極は、その後、炭素繊維のアンペロメトリーと小胞からのカテコールアミン放出を検出するために使用されます。
Abstract
炭素繊維電極は、電流測定の測定のための単一細胞内小胞からのカテコールアミンの放出を検出するために重要です。ここで、我々は、低ノイズ（<0.5 Pa）の電極を生成するために必要なテクニックを説明します。技術は、以前の研究（1,2）によって発行された記述から変更されています。電極は、炭素繊維を作製し、繊維を吸引するフィルターで真空を使用して、各キャピラリーチューブに個別にスレッドによって行われます。次に、繊維と毛細管は微尖った先端で二つの部分、それぞれを作成し、電極プラーによってプルアップされています。電極はエポキシガラスのシールを作成するための硬化剤と混合して熱い、液状エポキシ樹脂に浸漬されています。最後に、電極はエポキシ樹脂を硬化するオーブン内に配置されます。電極を慎重に取り扱い、それらが一貫して損傷することなく行われることを保証することが重要です。このプロトコルは、単一細胞から記録するための電流測定電極を作製し、カットする方法を示しています。
Protocol
パート1：炭素繊維の調製
- キャピラリーピペットの〜1.25 ×長さは長さの炭素繊維（我々は7μm径を使用する）の束をカット。
- 〜コンテナ内のアセトン100mLの沸騰によるサイジングを外し、30分以上熱い、沸騰アセトンに繊維を追加。
- 暖かいアセトンから繊維を取り出し、そして新鮮なアセトンの50〜100 mLできれいなビーカーに移す。
- オープン150ミリメートルペトリ皿とairdry一晩にバンドルを配置することにより乾燥した繊維。
パート2：火 - 研磨ガラス毛細管
- 鉗子を中心にチューブを保持し、約flame.Rotateチューブに端を公開することにより、（我々は長いマイクロヘマトクリット毛細管は1.5mm外径、1.3ミリメートル内径、7.5センチメートルを使用）各キャピラリーチューブを火 - ポーランド炎の中に3回。
- チューブを逆さにして、再度3回回転させ、炎に反対側の端を置きます。
- ガラス皿にファイアーポリッシュチューブをセットし、彼らは炭素繊維で満たされることの準備が整うまで、オーブンに移す。
第3部：キャピラリーチューブにカーボン繊維をスレッディング
- マチャドらの説明に似て。 （2008年）とMundroffとワイトマン（2002）は、フィルタを真空に接続されているプラスチック製のチューブを使用してガラス管に繊維を吸う。
- チューブの繊維の外のscalpel.Leave ¼インチを使用して繊維をカット。
パート4：電極プラーでピペットファイバを引っ張る
- 電極プラー（我々はナリシゲ日本モデルPP - 830を使用）にキャピラリーチューブを置き、場所にキャピラリチューブを保持するためにノブを締めて。
- 最適な引き手の設定で設定され、二人プル実行するためにスイッチを操作する。
- ピペットが半分に引っ張られると、ハサミを使って中心にベアファイバを切断して二つの部分を分ける。
- 各電極の半分を削除し、繊維の1 / 8インチのチューブの外に残されるように、はさみでガラスseal.Trimの繊維を壊すために突き出したファイバーを引っ張る。
- 約16繊維電極が引き出されるまで繰り返し、1〜4を繰り返します。
第5部：エポキシグラスのシールを作る
- ドラフトで6分間55℃に設定したホットプレート上でエポキシの既製のアリコートを加熱する。
- エポキシは、ラップを加熱している間〜束に引っ張ら電極16をテープを使用して。
- エポン樹脂が6分間加熱された後、ホットエポン樹脂（14％、w / v）の0.7グラムXOF MPDAを追加。バイアルを渦巻くことによりミックス。
- エポキシの十分な量が毛細管現象を介してガラスのヒントを入力する、20秒程度のホットエポキシプラス硬化剤のsolution.Afterに電極の束をつけます。
- スロットで段ボールにバンドル、場所の電極を元に戻すと、オーブンでこのトレイを置く、100℃に設定F.
- 少なくとも48時間後、、エポキシ樹脂で埋めるこわれた先端を持って、、それぞれの電極を検査段ボールホルダーの所定の位置に戻すとバック、複数のファイバー、etc.Afterを持っていなかった解剖microscope.Discard電極の下に各電極を調べるoven.Electrodesに通常製造後約1ヵ月に適しています。
第6部：炭素繊維を切断
- テフロンテープでスライドガラスの上に慎重に炭素繊維電極を置きます。
- 解剖顕微鏡の下に先端を可視化する。
- 細胞に対する炭素繊維を配置するための平坦な清浄な表面を残すために炭素繊維を垂直に横切っカットするクリーンな手術用メスの刃を使用してください。
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Discussion
このプロトコルは、電流滴電極を生成し、カットする方法について説明します。電流測定の録音中に、炭素繊維の電極は、分泌細胞の表面に配置されます。エキソサイトーシス活性は、カテコールアミンの酸化後の電子の移動によって生じる電気化学的電流を示す電流測定スパイクとして観測される。練習は作るとアンペロメトリック電極を切断すると、ノイズレベルを大幅に市販の電極の多くにわたって改善することができます。
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Acknowledgments
我々は、このプロトコルが最初に設計され、その研究室で、シカゴ大学で博士アーロンP.フォックスに感謝、そしてプロトコルのさらなる発展のためのウィリアムローデン（セントルイス大学）。
私たちは、ホワイトホール財団と支援のための国立科学財団に感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
