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Biology

Amperometric इलेक्ट्रोड के निर्माण कार्य

doi: 10.3791/1040 Published: May 4, 2009

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे उत्पन्न करने के लिए कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड. बाद में इलेक्ट्रोड कार्बन फाइबर amperometry के साथ vesicles से catecholamine रिहाई का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है.

Abstract

कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड amperometry मापन के लिए एकल कक्षों में vesicles से catecholamine रिहाई का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं. यहाँ, हम कम शोर इलेक्ट्रोड (<0.5 PA) उत्पन्न करने के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन. तकनीक पिछले शोधकर्ताओं (1,2) द्वारा प्रकाशित विवरण से संशोधित किया गया है. इलेक्ट्रोड कार्बन फाइबर की तैयारी और उन्हें व्यक्तिगत रूप से एक फिल्टर के साथ एक निर्वात का उपयोग करने के लिए फाइबर aspirate द्वारा प्रत्येक केशिका ट्यूब में सूत्रण द्वारा बनाई गई हैं. अगला, केशिका ट्यूब फाइबर के साथ एक इलेक्ट्रोड खींचने द्वारा खींचा जाता है, ठीक बताया टिप के साथ दो halves, प्रत्येक बनाने. इलेक्ट्रोड, गर्म तरल hardener के साथ मिश्रित करने के लिए एक epoxy गिलास मुहर बनाने epoxy में डूबा हुआ हैं. अन्त में, इलेक्ट्रोड एक ओवन में रखा जाता है epoxy इलाज. इलेक्ट्रोड की सावधानी से निपटने के लिए सुनिश्चित करना है कि वे लगातार और बिना किसी नुकसान के बना रहे हैं महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे बनाना और एकल कक्षों से रिकॉर्डिंग के लिए amperometric इलेक्ट्रोड में कटौती.

Protocol

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भाग 1: कार्बन फाइबर तैयार

  1. कार्बन फाइबर का एक बंडल (हम 7μm व्यास उपयोग) कट लंबाई 1.25 ~ X केशिका पिपेट की लंबाई है.
  2. उबलते द्वारा साइज़िंग निकालें ~ एक कंटेनर में एसीटोन के 100 एमएल और गर्म, 30 मिनट या उससे अधिक समय के लिए उबलते एसीटोन फाइबर जोड़ने.
  3. गर्म एसीटोन से फाइबर निकालें, और ताजा एसीटोन के 50-100 एमएल के साथ एक साफ बीकर को हस्तांतरण.
  4. एक खुला 150 मिमी पेट्री डिश पर बंडल रखने और airdry रात भर सूखी फाइबर.

भाग 2: आग चमकाने ग्लास केशिका ट्यूब

  1. केंद्र में संदंश के साथ ट्यूब और flame.Rotate ट्यूब के बारे में पकड़े अंत उजागर द्वारा प्रत्येक केशिका ट्यूब (हम माइक्रो केशिका ट्यूब hematocrit, 1.5mm बाहरी व्यास, 1.3mm भीतरी व्यास, 7.5cm लंबे समय का उपयोग करें) आग पॉलिश 3 बार लौ में हुए.
  2. ट्यूब उलटें और लौ के विपरीत अंत में जगह है, फिर 3 बार घूर्णन.
  3. एक गिलास पकवान में आग पॉलिश ट्यूबों प्लेस और ओवन के लिए स्थानांतरण जब तक वे कार्बन फाइबर के साथ भरा होना करने के लिए तैयार हैं.

भाग 3: एक केशिका ट्यूब में एक कार्बन फाइबर सूत्रण

  1. मचाडो एट अल द्वारा वर्णन करने के लिए इसी प्रकार. (2008) और Mundroff और Wightman (2002), कांच ट्यूब में प्लास्टिक से जुड़े एक फिल्टर के साथ एक निर्वात ट्यूबिंग का उपयोग कर फाइबर चूसना.
  2. Scalpel.Leave ¼ इंच ट्यूब फाइबर बाहर का उपयोग फाइबर कट.

भाग 4: एक इलेक्ट्रोड डांड़ी में पिपेट फाइबर पुलिंग

  1. इलेक्ट्रोड खींचने (हम Narishige जापान पीपी-830 मॉडल का उपयोग करें) में केशिका ट्यूब प्लेस और knobs कसने के लिए जगह में केशिका ट्यूब पकड़.
  2. दो इष्टतम खींचने सेटिंग्स पर सेट खींचती है, निष्पादित करने के लिए स्विच हेरफेर.
  3. एक बार विंदुक आधे में खींच लिया है, कैंची का उपयोग करने के केंद्र में नंगे फाइबर काटने से दो halves अलग.
  4. प्रत्येक इलेक्ट्रोड आधा निकालें और उभड़नेवाला कांच seal.Trim कैंची ताकि केवल 1 / 8 इंच फाइबर के ट्यूब के बाहर छोड़ दिया है के साथ फाइबर फाइबर को तोड़ने पर पुल.
  5. दोहराएँ चरण 16 के बारे में फाइबर इलेक्ट्रोड खींच रहे हैं जब तक 1-4.

भाग 5: Epoxy-ग्लास सील करना

  1. एक गर्म 55 के लिए सेट थाली पर epoxy के एक पूर्व बनाया विभाज्य हीट डिग्री सेल्सियस धूआं हुड में 6 मिनट के लिए.
  2. जबकि epoxy लपेटो, गर्म है एक बंडल में टेप का उपयोग करके ~ खींच इलेक्ट्रोड के 16.
  3. बाद EPON राल 6 मिनट के लिए गरम किया जाता है, शीशी घूमता गर्म EPON राल (14%, w / v) 0.7 ग्राम XOF MPDA जोड़ मिक्स.
  4. गर्म से अधिक 20 सेकंड के बारे में hardener solution.After epoxy में इलेक्ट्रोड के बंडल डुबकी, epoxy की एक पर्याप्त राशि केशिका क्रिया के माध्यम से गिलास युक्तियाँ में प्रवेश करेंगे.
  5. गत्ता पर बंडल, जगह इलेक्ट्रोड स्लॉट के साथ पूर्ववत करें और एक ओवन में इस ट्रे जगह 100 के लिए सेट ° एफ
  6. कम से कम 48 घंटे के बाद, एक विदारक microscope.Discard इलेक्ट्रोड है कि epoxy के साथ नहीं भर था, एक तोड़ी टिप है, एक से अधिक फाइबर, etc.After प्रत्येक इलेक्ट्रोड का निरीक्षण, उन्हें गत्ता धारक पर जगह वापस और वापस तहत प्रत्येक इलेक्ट्रोड की जांच में oven.Electrodes आम तौर पर निर्माण के बाद के बारे में 1 महीने के लिए अच्छा कर रहे हैं.

भाग 6: कार्बन फाइबर काटना

  1. प्लेस कार्बन फाइबर Teflon टेप के साथ एक गिलास स्लाइड पर ध्यान इलेक्ट्रोड.
  2. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे टिप कल्पना.
  3. एक स्वच्छ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए कार्बन फाइबर भर लंबरूप में कटौती करने के लिए एक सेल के खिलाफ कार्बन फाइबर के स्थान के लिए एक फ्लैट साफ सतह छोड़.

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पैदा करते हैं और amperometric इलेक्ट्रोड में कटौती. Amperometric रिकॉर्डिंग के दौरान, एक कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड एक स्रावी सेल की सतह के खिलाफ रखा गया है. Exocytotic गतिविधि amperometric spikes, जो विद्युत catecholamines के ऑक्सीकरण के बाद इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण की वजह से वर्तमान इंगित करता है के रूप में मनाया जाता है. अभ्यास कर रही है और amperometric इलेक्ट्रोड काटने के साथ, शोर का स्तर बहुत अधिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इलेक्ट्रोड के कई सुधार किया जा सकता है.

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Acknowledgments

हम शिकागो विश्वविद्यालय में डॉ. हारून पी. फॉक्स धन्यवाद, जिनकी प्रयोगशाला में इस प्रोटोकॉल मूल रूप से डिजाइन किया गया था, और प्रोटोकॉल के विकास के लिए आगे विलियम Roden (सेंट लुई विश्वविद्यालय).

हम व्हाइटहॉल फाउंडेशन और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के समर्थन के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes Reagent Sigma-Aldrich P23954-100G04 716AJ Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers Material Goodfellow C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes Material Fisher Scientific NC9836768
Epoxy Resin Reagent Miller-Stephenson Epon Resin 828
Dissecting Microscope Instrument
Electrode Puller Instrument Narishige International PP-830 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven Instrument set to 100 degrees F.
Hot plate Instrument set to 55 degrees C

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References

  1. Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6, (14), 1-6 (2002).
  2. Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
Amperometric इलेक्ट्रोड के निर्माण कार्य
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Cite this Article

Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040, doi:10.3791/1040 (2009).More

Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040, doi:10.3791/1040 (2009).

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