Summary
Bu protokol, karbon fiber elektrotlar oluşturmak anlatılmaktadır. Bu elektrotlar daha sonra, karbon fiber amperometri ile veziküller katekolamin sürüm algılamak için kullanılır.
Abstract
Karbon fiber elektrotlar amperometri ölçümler için tek hücre veziküller katekolamin salınımının tespiti için çok önemlidir. Burada, düşük gürültü (<0,5 pA) elektrotlar üretmek için gerekli teknikler açıklanmaktadır. Teknikleri önceki araştırmacıların (1,2) tarafından yayınlanan açıklamaları modifiye edilmiştir. Elektrotlar karbon elyaf hazırlama ve lif aspire bir filtre ile vakum kullanarak her kapiller tüpe ayrı ayrı iş parçacığı tarafından yapılır. Sonra, fiber ile kılcal tüpü ince sivri ucu ile iki yarısı, her bir elektrot çektirmenin tarafından çekilir. Elektrotlar sıcak, sıvı epoksi, epoksi-cam bir mühür oluşturmak için sertleştirici ile karışık batırılmış. Son olarak, epoksi kür için bir fırın elektrotlar yerleştirilir. Elektrotlar dikkatli kullanımı, tutarlı bir şekilde ve zarar vermeden yapılır sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol tek hücre kayıt için amperometrik elektrotlar imal ve nasıl kesileceğini gösterir.
Protocol
Bölüm 1: Karbon Elyaf Hazırlama
- Kapiller pipet ~ 1.25 X uzunluğu bir uzunlukta bir paket karbon elyaf (7μm çapı) kesin.
- Kaynama boyutlandırma kaldırın ~ 100 mL ve bir kap içinde aseton, 30 dakika veya daha uzun bir süre için kaynar aseton lifler.
- Sıcak aseton lifler çıkarın ve temiz bir behere 50-100 ml taze aseton transfer.
- Kuru, açık bir 150 mm Petri kabında paket yerleştirerek ve airdry geceleme fiberler.
Bölüm 2: Yangın parlatma Cam Kapiler Tüp
- Forseps ile tüp merkezi holding ve ilgili flame.Rotate tüp sonunda açığa (uzun mikro-hematokrit kapiller tüpler, dış çapı 1.5mm, 1.3mm iç çapı 7,5 cm) Her bir kapiller tüp Yangın lehçe 3 kez alev.
- Tüpü ters çevirin ve 3 kez tekrar dönen, ateşe diğer ucunu yerleştirin.
- Cilalı yangın tüpleri bir cam tabak koyun ve karbon elyaf ile dolu olmak için hazır olana kadar fırın transfer.
Bölüm 3: Kılcal Tüp içine bir Karbon Fiber Threading
- Machado ve ark açıklamalara benzer. (2008) ve Mundroff ve Wightman (2002), bir filtre ile vakum bağlı plastik boru kullanarak cam tüp içine fiber emmek.
- Lif lif dışında bir tüp scalpel.Leave ¼ inç kullanarak kesin.
Bölüm 4: Bir Elektrot Çektirme Pipet-Fiber Çekme
- Kapiler tüp elektrot çektirmenin (Narishige Japonya Model PP-830) içine yerleştirin ve yerinde kılcal tüpü tutmak için düğmeleri sıkın.
- Optimal çektirmenin ayarlarında iki set çeker yürütmek için anahtarları işleyin.
- Pipet yarıya çekilir sonra, çıplak fiber kesme makası kullanarak merkezinde iki yarısı ayrı.
- Her elektrot yarım çıkarın ve çıkıntılı lif lif lif sadece 1 / 8 inç tüp dışında kalmaması için makas ile cam seal.Trim kırmak için çekin.
- Fiber elektrotlar çekti yaklaşık 16 kadar 1-4 adımları tekrarlayın.
Bölüm 5: Epoxy-Cam Seal yapma
- Epoksi önceden yapılmış bir kısım sıcak bir plaka ile 55 ° C sıcaklığındaki bir davlumbaz 6 dakika.
- Epoksi, sargı bandı kullanarak bir paket içine çekti elektrotlar ~ 16 ısıtma iken.
- EPON Reçine, 6 dakika ısıtılır sonra, 0.7 gram XOF MPDA sıcak EPON Reçine (% 14 w / v) ekleyip karıştırın flakon dönen.
- Epoksi yeterli miktarda kapiller eylem yoluyla cam ipuçları girecek elektrot paket, 20 saniye ile ilgili sıcak epoksi artı sertleştirici solution.After içine batırın.
- Yuvaları ile karton üzerine paket, yer elektrotlar geri alma ve bir fırın tepsiye yerleştirin 100 ° F.
- En az 48 saat sonra, epoksi ile doldurmak, parçalanmış bir ipucu var, birden fazla fiber, etc.After var, her elektrot teftiş karton sahibinin onları geri geri vermedi diseksiyon microscope.Discard elektrotlar altında incelemek her elektrot oven.Electrodes genellikle fabrikasyon sonra yaklaşık 1 ay için iyi içine.
Bölüm 6: Karbon Fiber Kesme
- Yeri karbon fiber bir teflon bant ile cam slayt üzerine dikkatle elektrodudur.
- Diseksiyon mikroskobu altında ucu gözünüzde canlandırın.
- Bir hücre karşı karbon fiber yerleştirme için temiz düz bir yüzey bırakmak için karbon fiber boyunca dik kesmek için temiz bir neşter bıçak kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol amperometrik elektrotlar oluşturmak ve nasıl kesileceği açıklanmıştır. Amperometrik kayıtları sırasında, karbon fiber bir elektrot bir salgı hücre yüzeyine karşı yerleştirilir. Exocytotic faaliyet katekolamin oksidasyonu sonra elektron transferi ile oluşan elektrokimyasal akım gösterir amperometrik ani olarak görülmektedir. Pratik yapma ve kesme amperometrik elektrotlar sayesinde, piyasada bulunan elektrotlar pek çok üzerinde gürültü seviyeleri büyük ölçüde geliştirilmiş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu protokol başlangıçta tasarlanmış olan laboratuar, Chicago Üniversitesi'nde Dr. Aaron P. Fox teşekkür eder, ve daha da geliştirilmesi için protokol William Roden (Saint Louis Üniversitesi).
Biz Whitehall Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
