Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Изготовление Амперометрический Электроды

doi: 10.3791/1040 Published: May 4, 2009

Summary

Этот протокол описывает, как создавать электроды углеродного волокна. Электроды в дальнейшем использоваться для обнаружения катехоламинов освобождение от пузырьков с углекислым amperometry волокна.

Abstract

Электроды из углеродного волокна имеют решающее значение для выявления выпуска катехоламинов из везикул в одиночных камерах для amperometry измерений. Здесь мы описываем методы, необходимые для создания низкий уровень шума (<0,5 мкА) электроды. Методы были изменены из опубликованных описаний предыдущими исследователями (1,2). Электроды изготавливаются путем подготовки углеродных волокон и резьбы по отдельности в каждом капилляре с помощью вакуума с фильтром для аспирации волокна. Далее, капиллярная трубка с волокна, запряженных электрода съемник, создавая две половины, каждая из которых тонкой заостренной верхушкой. Электроды, смоченным в горячей, жидкой эпоксидной смешивается с отвердителем для создания стеклотекстолита печатью. Наконец, электроды помещаются в печь, чтобы вылечить эпоксидной смолы. Тщательная обработка электродов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы они сделаны последовательно и без повреждений. Этот протокол показывает, как изготовить и сократить амперометрического электроды для записи от отдельных клеток.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Часть 1: Подготовка Carbon Fiber

  1. Вырезать пучка углеродных волокон (мы используем 7 мкм в диаметре) в длину, которая составляет ~ 1,25 х длина капиллярной пипетки.
  2. Удалить размеров путем кипячения ~ 100 мл ацетона в контейнер и добавление волокна к горячему, кипящего ацетона в течение 30 минут или дольше.
  3. Удалить волокон из теплого ацетона, и трансфер в стакан с чистой 50-100 мл свежего ацетона.
  4. Сухие волокна путем размещения расслоение на открытом 150 мм блюдо Петри и airdry ночь.

Часть 2: Огонь-полировка стеклянные капилляры

  1. Пожар-польский каждого капилляра (мы используем микро-гематокрита капиллярных трубок, наружный диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,3 мм, 7,5 см в длину), держа трубку в центр с пинцетом и выставляя конец flame.Rotate трубку о 3 раза в то время как в пламени.
  2. Обратить трубки и место противоположный конец к пламени, снова вращающиеся в 3 раза.
  3. Место огневой полировкой труб в стеклянную посуду и трансфер в духовке, пока они не готовы быть заполнены углеродных волокон.

Часть 3: Threading углеродного волокна в капиллярной трубке

  1. Как и описаний Мачадо и соавт. (2008) и Mundroff и Вайтмана (2002), сосать волокна в стеклянную трубку с использованием пластиковых трубки подключены к вакуум с фильтром.
  2. Вырезать волокну с использованием scalpel.Leave ¼ дюйма волокон из трубки.

Часть 4: Тяговая Внесите-волокна в Электрод Puller

  1. Место капиллярной трубке в электрод съемник (мы используем Narishige Японии модель ПП-830) и затяните ручки провести капиллярная трубка на месте.
  2. Манипулирование переключателями выполнить два тянет, заход в оптимальные настройки съемника.
  3. После пипеткой вытягивается в два раза, отдельно две половины резки голого волокна в центре с помощью ножниц.
  4. Удалить каждый электрод пополам и потяните выступающие волокна разбить стекло seal.Trim волокна с ножницами так, что только 1 / 8 дюйма волокон остается за пределами трубы.
  5. Повторите шаги 1-4, пока около 16 волоконно-электроды вытащил.

Часть 5: Создание стеклотекстолита печать

  1. Тепло готовых аликвоту эпоксидной на горячей плите установлен в 55 ° С в течение 6 минут в вытяжном шкафу.
  2. Хотя смола отопления, оберните ~ 16 из вытащил электродов в пучок с помощью ленты.
  3. После Смола Epon нагревается в течение 6 минут, добавить 0,7 г XOF MPDA к горячей смолой Epon (14%, в / о). Mix, вращая флакон.
  4. Dip пучок электродов в горячей эпоксидной плюс отвердитель solution.After около 20 сек, достаточным количеством эпоксидной войдет стекла советы по капиллярного действия.
  5. Отменить расслоение, электроды место на картон с прорезями и место этот лоток в духовку до 100 ° F.
  6. После по меньшей мере 48 часов, рассмотрим каждый электрод под рассекает microscope.Discard электроды, которые не заполняются эпоксидной смолы, имеют разбил отзыв, иметь более одного волокна, etc.After проверки каждого электрода, место их на картон держателя и обратно в oven.Electrodes, как правило, хорошие в течение 1 месяца после изготовления.

Часть 6: Раскрой Carbon Fiber

  1. Место волокна углерода электродом внимательно на предметное стекло с тефлоновой лентой.
  2. Визуализируйте наконечник при вскрытии микроскопом.
  3. Используйте чистую лезвие скальпеля, чтобы сократить перпендикулярно углеродного волокна оставить плоский чистую поверхность для размещения углеродного волокна от клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает, как создавать и сократить амперометрического электродов. Во время амперометрического записей, электрод из углеродного волокна помещают на поверхность секреторных клеток. Exocytotic активность наблюдается как амперометрического шипы, который показывает текущее электрохимической вызванных переносом электронов после окисления катехоламинов. С практикой решений и резки амперометрического электроды, уровень шума может быть значительно улучшилась за многие из имеющихся в продаже электродов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Аарон П. Фокс в Чикагском университете, в лаборатории которого этот протокол был первоначально разработан, и Уильям Роден (Saint Louis University) для дальнейшего развития протокола.

Мы благодарим Фонд Уайтхолл и Национальный научный фонд для поддержки.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes Reagent Sigma-Aldrich P23954-100G04 716AJ Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers Material Goodfellow C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes Material Fisher Scientific NC9836768
Epoxy Resin Reagent Miller-Stephenson Epon Resin 828
Dissecting Microscope Instrument
Electrode Puller Instrument Narishige International PP-830 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven Instrument set to 100 degrees F.
Hot plate Instrument set to 55 degrees C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6, (14), 1-6 (2002).
  2. Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
Изготовление Амперометрический Электроды
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040, doi:10.3791/1040 (2009).More

Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. Fabrication of Amperometric Electrodes. J. Vis. Exp. (27), e1040, doi:10.3791/1040 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter