Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول يستخدم لدراسة الخلايا المكونة للدم صاروخ موجه لمطلبهم في نخاع العظام.
Abstract
هو صاروخ موجه الخلايا المكونة للدم الظاهرة حيث زرع قادرين على السفر من وتدبر أو إقامته في نخاع العظام. وتشارك chemomkines المختلفة والمستقبلات في صاروخ موجه من الخلايا الجذعية المكونة للدم. [1 ، 2]
هذه الورقة الخطوط العريضة للبروتوكول صاروخ موجه الكلاسيكية المستخدمة في دراسات الخلايا الجذعية المكونة للدم. عموما هذا ينطوي على عزل السكان الخلية التي هومينغ يحتاج إلى التحقيق ، وتلطيخ هذه الفئة من السكان مع صبغة من الفائدة وحقن هذه الخلايا في مجرى الدم من الحيوان المتلقي. وضحى ثم الحيوان المتلقي في وقت محدد مسبقا بعد الحقن ونخاع العظم لتقييم النسبة المئوية أو العدد المطلق للخلايا التي هي ايجابية لصبغ الفائدة. في واحدة من مخططات تجريبية الأكثر شيوعا ، وكفاءة صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم من اثنين من حيوانات مختلفة وراثيا (نوع حيوان البرية والمناظر بالضربة القاضية) ومقارنتها. توضح هذه المقالة بروتوكول الخلايا المكونة للدم صاروخ موجه في إطار مثل التجربة.
Protocol
- نبدأ تجربة صاروخ موجه من خلال استخراج خلايا لاستخدامها في التجربة. عن هذه التجربة الحالية ونحن مهتمون في معرفة إذا كان صاروخ موجه من نخاع العظم بأكملها إلى محاريب في العظام الطويلة من الحيوانات المتلقي هو مختلف عن خلايا نخاع العظام المستخرجة من الحيوانات مثل WT C57BL/6J (WT) وتلك التي المعدلة وراثيا بالضربة القاضية لمستقبلات Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO).
- قبل أن نبدأ في التجربة ، وسوف نقوم بجمع المواد التي نحتاجها لهذه التجربة. في مختبرنا يتم تنفيذ جميع تشريح الفأر في غطاء تدفق الصفحي زراعة الأنسجة وخاصة إذا كانت الخلايا المزروعة ستكون في الحيوان المتلقي بدلا من أن تستخدم لتحليل فيفو السابقين. نبدأ بوضع ورقة زرقاء داخل غطاء محرك السيارة. وتشمل الكائنات الأخرى اللازمة زوج من الملقط وزوج من مقص حاد والتي تم تعقيمها ، ومسحات معقمة المتاح مشرط والكحول. وتصدرت مدقة ، الأزرق 50cc ل سنحتاج برنامج تلفزيوني العقيمة المعدلة و6 وحة جيدا ، وقذيفة هاون ، أنبوب مخروطي الشكل وتصفية 70uM المتاح.
- نبدأ اتخاذ واحد واحد وزن الماوس KO.
- يصرح باستخدامها في هذه الفئران عن طريق الاستنشاق 2 أكسيد الكربون وانخفض بنسبة 70 ٪ ثم في isopropranolol لمدة 5 ثوان. هذه الخطوة إلى منع التلوث من الخلايا في المصالح مع الفراء والفأر بين أيدينا لم يؤد إلى أي حل وسط في الغلة من الخلايا أو نتائج تجريبية.
- ثم يتم تشريح الفئران بدوره باستخدام زوج من مقص وملقط حادة. نبدأ عادة مع الماوس WT كمسألة روتينية. يتم إجراء قص صغير في الجلد البطني من الفأرة التي تغمر البطن ، وامتدت بعد ذلك الجلد باستخدام اليدين. الجلد ويأتي قبالة أطرافه الخلفية بسهولة. ثم يتم استخراج عظم الفخذ والساق مع الحرص على عدم طرد رأس عظم الفخذ وهذا يحتوي على كمية كبيرة من النخاع العظمي. يتم فصل الأطراف العلوية من الجذع والحيوان من خلال تطبيق ببساطة جر لهم مع الحفاظ على الجذع متحركة. هذا يزيل الأطراف العلوية وقطعة واحدة. يتم استخراج ثم العضد من الأطراف العلوية.
- توضع العظام في إزالة PBS المحورة التي تمت إضافة إلى 6 لوحات جيدا. يتم إجراء تعديل في برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة 2 مل من مصل الجنين الحرارة المعطل البقري و 2 سم مكعب من 0.5 M EDTA pH8. ثم يتم تصفية هذا الحل من خلال مرشح Nalgene 0.45 أوقية ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر على الأقل.
- لا بد من تسمية الآبار في لوحة من أجل أن تكون قادرة على تحديد وزن والعظام KO بشكل صحيح.
- تتم إزالة جثث الماوس والتخلص منها.
- يتم وضع ورقة جديدة في غطاء المحرك ويتم تنظيف العظام باستخدام مشرط المتاح.
- توضع العظام one تنظيف الماوس في وقت واحد في الهاون. يضاف اثنين مل من برنامج تلفزيوني لتعديل هاون وسحق العظام باستخدام مدقة. من المهم أن تفتيت عظام أولا مع 10 الى والحركات جيئة وذهابا من مدقة ثم يطحنون لهم مع حركات دائرية تدويرية. أفعل عادة في اتجاه عقارب الساعة 50 ، ثم 50 حركات عقارب الساعة ، وهلم جرا ، حتى المواد المتروكة في هاون وأبيض اللون ، وإضافته إلى برنامج تلفزيوني تعديل المادة لا تزال بيضاء أو شفافة.
- بعد كل مجموعة من حركات دائرية 50 السحق ، ونحن نقل السائل من قذائف الهاون على تصفية 70 أوقية وضعت على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. لا تنس أن تضيف 2 مل من برنامج تلفزيوني للهاون بعد كل عملية نقل للتصفية. كنت لا تريد أن تجرب ويطحنون العظام الجافة أو تركها جافة ولأي مدة من الزمن حيث ان هذا سوف يؤدي الى موت الخلايا المبرمج للخلايا.
- مرة واحدة في المواد هاون يصبح أبيض ، يتم نقل المواد في تصفية للهاون ويتم تنفيذ مرة أخرى السحق. هذا يضمن أن لا يضيعوا هذه الخلايا في التصفية. وعادة ما يأخذ واحدة أو مجموعتين من الحركات الدائرية تدويري مرة أخرى لجعل هذه المادة في الأبيض هاون في اللون في الوقت الذي استخراج خلايا كاملة.
- الآن يتم طرد الحل في أنبوب المخروطية (يرجى تذكر للحفاظ على الخلايا من وزن والفأر KO منفصلة ، وبالتالي سيكون لديك أنبوبين مختلفة (واحدة مع خلايا وزن ، والآخر مع الخلايا KO). جهاز طرد مركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
- نضح قبالة طاف به ماصات الشافطة منفصلة لكل أنبوب. إضافة 2 سم مكعب من تحلل ACK العازلة لكل بيليه. وينبغي أن يكون هذا المخزن المؤقت تحلل العقيمة. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة 8 سم مكعب من تعديل برنامج تلفزيوني على كل أنبوب. يستغرق 10 ماي من كل أنبوب وماصة في بئرين منفصلة في 96 لوحة جيدا. وضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وزيادة ونقصان في 1200 دورة في الدقيقة لهم لمدة 10 دقيقة.
- في حين أن الأنابيب هي الغزل ، وإضافة 30 ماي من صبغة زرقاء tryphan و 60 من المجاهدين في برنامج تلفزيوني لتعديل كل بئر من 96 لوحة جيدا أن يحمل خلايا الفائدة.
- إضافة 10 ماي من هذا الخليط (يرجى مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا) إلى عدادة الكريات وعدد الخلايا في الساحات four الخارجي.
- عدد الخلايا في كل عينة لكل مل هو عدد الخلايا عدها بذلك مقسوما 4 و multiplieد ب 100 000.
- بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، وإزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بدون المغنيسيوم والكالسيوم أو الجلوتامين بتركيز 20 مليون خلية لكل مل. سيكون لديك على الأرجح حوالي 5 مل من الصوت لوزن وحجم 5 مل للحيوان KO. من هذه الخطوة فصاعدا سنكون باستخدام برنامج تلفزيوني ، لم يتم تعديل برنامج تلفزيوني للبروتوكول.
- إضافة إلى كل أنبوب الجاذبة ، صبغة تلوين الخلية ، لتحقيق تركيز 5uM النهائي. دوامة فورا لمدة 10 ثانية. احتضان عند 37 درجة لمدة 10 دقائق ، وتجنب التعرض للضوء.
- ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني وتدور لمدة 10 دقيقة في 1200 دورة في الدقيقة.
- بعد الطرد المركزي ، نضح في وطاف resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني ب 40 مليون خلية لكل مل.
- تحميل المجاهدين في 500 سم مكعب 1 المحاقن مع إبرة 27G (5 المحاقن لوزن الماوس و 5 حقن الفئران لKO). قد يكون من الحكمة أن إعداد 6 المحاقن لكل الفئات. وجود واحد اضافي يمكن أن تساعد على شكل حقن الوريد الذيل الذي نحن بصدد القيام به بعد ذلك يمكن أن تكون خادعة.
- تغطية المحاقن برقائق من أجل الحفاظ على الجاذبة من التفكك.
- ضخ 500 UL من خليط الخلية في كل حيوان المتلقية ؛ (5 لكل فوج).
- هذه الحيوانات تحتاج إلى المشع مع 9 غراي تشعيع 4-24 ساعة قبل عملية الحقن.
- بعد 48 ساعة من الحقن ، والحصاد نخاع العظم من أطرافه الخلفية من كل حيوان المتلقية.
- العملية كما هو موضح أعلاه للمانحين. Resuspend الخلايا من كل حيوان في 1 سم مكعب من برنامج تلفزيوني. الحصول على خلايا باستخدام عدادة الكريات.
- قراءة على تدفق عداد الكريات LSR الثاني من دينار بحريني أو ما يعادل صك. ويمكن التعبير عن النتيجة كنسبة مئوية أو العدد المطلق للخلايا في النخاع العظمي التي هي ايجابية حلل الجاذبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
صاروخ موجه هو عملية يتم بموجبها خلايا نخاع العظام بما في ذلك الخلايا الجذعية ، والخلايا الاصلية وخلايا متباينة ، طريقها إلى نخاع العظم بعد حقنها في مجرى الدم أو نخاع العظم تجويف من الفئران. كما هو واضح من التعريف ، قد اختار العلماء لدراسة صاروخ موجه من الخلايا الجذعية المكونة للدم ، والخلايا السلف أو الخلايا المتمايزة التي حددتها immunophenotyping ومعزولة عن طريق الفرز الخلية. عادة العلماء بحقن خلايا نخاع العظم لالمنضب علامات الانساب وبالتالي إثراء للسلف والخلايا الجذعية.
جرعة من حقن خلايا الفائدة هو المتغير في هذه التجربة. يمكن لعدد من الخلايا تختلف من 500 000 في الماوس المتلقي إلى 20 مليون دولار في الماوس المتلقي. لمزيد من الخلايا يمكن للمرء أن حقن الأسهل الكشف في نخاع العظام. قد الخلية توافر عدد الحد من عدد حقن. فرز 20000000 LKS الخلايا SLAM صعبة للغاية وربما غير عملي حتى مع التكنولوجيات الحالية في معظم بيئات المختبرات ، وفي هذه الحالة يمكن للمرء أن تقرر استخدام عدد من الخلايا نحو الطرف الأدنى من النطاق المذكور أعلاه.
ويمكن أيضا للحيوان خرطوم التي هومينغ يجري درس تكون متنوعة. قد يكون هذا الحيوان المتلقي ماوس C57BL/6J WT المشع الذي تم مع 9 غرايز قاتلة من الإشعاع كما فعلنا في هذه التجربة ، ماوس C57BL/6J WT أو ماوس واط / ببخار الماء الذي لم المشع. إذا كان المشع الماوس أو لا يعتمد على سؤال المجرب تحاول الإجابة. إذا كان أحد المهتمين بدراسة صاروخ موجه في الإعداد حيث يتم الإفراج عن كمية كبيرة من السيتوكينات ويجري الناجم عن تسرب الأوعية الدموية ، ماوس WT المشع هو الاختيار المناسب. ويمكن حقن عدد أقل من خلايا (500 000) في وزن الفأر الذي لم المشع بحيث الخلايا الجذعية يمكن أن يعيش فيها عدد قليل من منافذ غير مأهولة دون الإرباك أعلاه.
W / WV الفئران تعاني من نقص في وظيفة مستقبلات C - KIT ، ويمكن تدبر الخلايا الجذعية دون أي شروط مسبقة. وهذا يسمح لنا لدراسة صاروخ موجه من الخلايا الجذعية في غياب إصابة الأوعية الدموية أو الإفراج خلوى الناجمة عن الاشعاع. مشكلة لوجستية مع استخدام هذه الفئران هي أنه من الصعب الحصول على العدد الكافي من الفئران WWv لتكون بمثابة المتلقين بسبب مخاوف تربية حجم مستعمرة.
باختصار ، استخدم الاختلافات على الرغم من أننا وصف بروتوكول قياسي صاروخ موجه ، وتعتمد على السؤال الذي يجب الإجابة ، ويجب أن يحدد خلال تصميم التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم اختبار هذا البروتوكول وتحسينه في مختبر الدكتور ديفيد Scadden. يتم توفير التمويل من معهد دانا فاربر للسرطان / مستشفى ماساتشوستس العام أمراض الدم والأورام السريرية برنامج الزمالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E.
