Summary
यह लेख एक अस्थि मज्जा में अपने niches के लिए hematopoietic कोशिकाओं के घर वापस आना अध्ययन इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Abstract
घर वापस आना जिससे प्रतिरोपित hematopoietic कोशिकाओं और टीका लगाना यात्रा या अस्थि मज्जा में निवास स्थापित कर रहे हैं घटना है. विभिन्न chemomkines और रिसेप्टर्स hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के घर वापस आना में शामिल हैं. [1, 2]
इस कागज क्लासिक घर वापस आना hematopoietic स्टेम सेल के अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की रूपरेखा. सामान्य में इस सेल की आबादी जिनके घर वापस आना की जरूरत के लिए जांच की जानी अलग, ब्याज की एक डाई के साथ इस आबादी को धुंधला हो जाना और एक प्राप्तकर्ता जानवर के रक्त प्रवाह में इन कोशिकाओं को इंजेक्शन शामिल है. प्राप्तकर्ता जानवर तो इंजेक्शन और अस्थि मज्जा प्रतिशत या जो ब्याज की डाई के लिए सकारात्मक रहे हैं कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या के लिए मूल्यांकन के बाद एक पूर्व निर्धारित समय पर बलिदान है. एक सबसे आम प्रयोगात्मक योजनाओं आनुवंशिक दो अलग जानवरों से hematopoietic कोशिकाओं (एक प्रकार जंगली जानवर और इसी दस्तक बाहर) के घर वापस आना दक्षता में तुलना है. इस अनुच्छेद के प्रयोग के रूप में इस तरह के ढांचे में hematopoietic सेल घर वापस आना प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Protocol
- हम करने के लिए प्रयोग में इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं को निकालने के द्वारा घर वापस आना प्रयोग शुरू करते हैं. इस वर्तमान प्रयोग के लिए हम बाहर ढूँढने में रुचि रखते हैं अगर प्राप्तकर्ता जानवरों की लंबी हड्डियों में niches के लिए पूरे हड्डी मज्जा के घर वापस आना अस्थि मज्जा की C57BL/6J (WT) जैसे WT जानवरों से निकाली कोशिकाओं के लिए अलग है और उन है कि ट्रांसजेनिक हैं Lysophosphatidic 1 रिसेप्टर (LPAR1) (KO) के लिए knockouts.
- इससे पहले कि हम प्रयोग शुरू, हम सामग्री हम इस प्रयोग के लिए की जरूरत है एकत्रित करेगा. हमारी प्रयोगशाला में सभी माउस dissections बाहर एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में किया जाता है, खासकर अगर कोशिकाओं को पूर्व vivo विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के बजाय एक प्राप्तकर्ता पशु में प्रत्यारोपित किया जा रहे हैं. हम डाकू अंदर एक नीली चादर रखकर शुरू करते हैं. अन्य आवश्यक वस्तुओं संदंश और जो autoclaved किया गया है कैंची की एक तेज जोड़ी की एक जोड़ी, एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल और शराब swabs शामिल हैं. हम संशोधित पीबीएस और एक बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली, एक मोर्टार की आवश्यकता होगी, मूसल, 50cc नीले शंक्वाकार ट्यूब और एक 70uM डिस्पोजेबल फिल्टर topped.
- हम एक WT और एक को माउस लेने के द्वारा शुरू करते हैं.
- इन चूहों सीओ 2 साँस लेना द्वारा euthanized हैं और फिर 5 सेकंड के लिए 70 isopropranolol% में डूबा हुआ है. इस कदम से रोकता माउस फर के साथ और हमारे हाथ में ब्याज की कोशिकाओं के संदूषण कक्षों या प्रयोगात्मक परिणाम की उपज में कोई समझौता करने के लिए नेतृत्व नहीं है.
- चूहे तो संदंश और तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर बारी में dissected हैं. हम आमतौर पर दिनचर्या के एक मामले के रूप में WT माउस के साथ शुरू करते हैं. एक छोटा सा पेट और त्वचा फिर हाथों का उपयोग कर फैला है overlying माउस के उदर त्वचा में कटाव किया है. त्वचा बंद हिंद अंग आसानी से आता है. जांध की हड्डी और टिबिअ तो ख्याल रख रही फीमर के सिर नहीं हटाना के रूप में इस अस्थि मज्जा की एक बड़ी राशि शामिल करने के लिए निकाले जाते हैं. ऊपरी अंगों बस उन्हें कर्षण आवेदन धड़ स्थिर रखते हुए जानवर धड़ से अलग कर रहे हैं. यह एक टुकड़े के रूप में ऊपरी अंगों को हटा. humeri तो ऊपरी अंगों से निकाले जाते हैं.
- हटाया हड्डियों संशोधित पीबीएस में रखा जाता है जो 6 अच्छी तरह प्लेटें में जोड़ा गया है. संशोधित पीबीएस गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 0.5 EDTA PH8 एम के 2 सीसी 2 मिलीलीटर जोड़कर बनाया जाता है. यह समाधान तो एक Nalgene 0.45 उम फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है और 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- यह क्रम में करने के लिए WT और हड्डियों को सही ढंग से पहचान करने में सक्षम हो थाली में कुओं लेबल के लिए आवश्यक है.
- माउस शवों को हटा दिया है और निपटारा कर रहे हैं.
- एक नए पत्रक हुड में रखा गया है और हड्डियों एक डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग कर साफ कर रहे हैं.
- साफ हड्डियों मोर्टार में एक समय पर एक माउस रखा जाता है. संशोधित पीबीएस के दो मिलीलीटर मोर्टार के लिए जोड़ा जाता है और हड्डियों को एक पैर का उपयोग कुचल कर रहे हैं. 10 के साथ करने के लिए और fro मूसल के आंदोलनों और फिर हड्डियों उन्हें परिपत्र अंग को घुमानेवाली पेशी का आंदोलनों के साथ छिटकाना यह पहली टुकड़ा करने के लिए महत्वपूर्ण है. मैं आमतौर पर 50 दक्षिणावर्त, तो 50 वामावर्त आंदोलनों और मोर्टार में छोड़ दिया है सामग्री तक संशोधित और पीबीएस रंग में सफेद है पर सामग्री के लिए सफेद या पारदर्शी रहता है.
- 50 परिपत्र आंदोलनों को कुचल के हर सेट के बाद, हम मोर्टार से एक 70 उम 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखा फिल्टर तरल स्थानान्तरण. फिल्टर करने के लिए हर स्थानांतरण के बाद मोर्टार पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए मत भूलना. आप सूखी हड्डियों के लिए कोशिश करते हैं और छिटकाना या समय के किसी भी लम्बाई के के लिए उन्हें सूखी छोड़ के रूप में इस कक्षों की apoptosis के लिए नेतृत्व करेंगे नहीं करना चाहती.
- एक बार मोर्टार में सामग्री सफेद हो जाता है, फिल्टर सामग्री में मोर्टार स्थानांतरित कर रहा है और कुचल फिर से प्रदर्शन किया है. यह सुनिश्चित करता है कि फिल्टर में कोशिकाओं को बर्बाद नहीं कर रहे हैं. आमतौर पर यह परिपत्र अंग को घुमानेवाली पेशी का आंदोलनों की एक या दो सेट लेता है फिर से रंग में सफेद मोर्टार में सामग्री है जो समय पर कक्षों की निकासी पूरा हो गया है.
- शंक्वाकार ट्यूब में समाधान अब centrifuged है (कृपया WT को और माउस अलग से कोशिकाओं को रखने के लिए याद है. इसलिए आप 10 के लिए 1200 rpm पर दो अलग अलग ट्यूबों (WT कोशिकाओं के साथ, एक को कोशिकाओं के साथ अन्य) अपकेंद्रित्र. होगा मिनट.
- प्रत्येक ट्यूब के लिए अलग Aspirator pipettes का उपयोग सतह पर तैरनेवाला Aspirate. प्रत्येक गोली ACK lysis बफर के 2 सीसी जोड़ें. इस lysis बफर बाँझ होना चाहिए. 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- प्रत्येक ट्यूब संशोधित पीबीएस के 8 सीसी जोड़ें. एक 96 अच्छी तरह से थाली में दो अलग - अलग कुओं में प्रत्येक ट्यूब से 10 उल और विंदुक ले लो. अपकेंद्रित्र में ट्यूबों प्लेस और उन्हें 10 मिनट के लिए 1200 rpm पर स्पिन.
- जबकि ट्यूबों कताई रहे हैं, 96 अच्छी तरह से थाली है कि ब्याज की कोशिकाओं को किया जाता है के प्रत्येक अच्छी तरह tryphan नीले डाई की 30 उल और संशोधित पीबीएस के 60 उल जोड़ें.
- Hemocytometer करने के लिए इस मिश्रण की 10 उल (कृपया ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से) जोड़ें और चार बाहरी वर्गों में कोशिकाओं गिनती.
- मिलीलीटर प्रति प्रत्येक नमूने में कोशिका गिनती इस प्रकार गिना कोशिकाओं की संख्या 4 और multiplie द्वारा विभाजित है100 से 000 घ.
- एक बार centrifugation पूरा हो गया है, अपकेंद्रित्र से ट्यूबों को हटाने और पीबीएस में कैल्शियम, या मिलीलीटर प्रति 20 लाख की कोशिकाओं के एक एकाग्रता में एल glutamine, मैग्नीशियम के बिना कोशिकाओं का resuspend. आप की संभावना को पशु के लिए 5 मिलीलीटर मात्रा के WT के लिए मात्रा के बारे में 5 मिलीलीटर है. इस कदम आगे से हम Pbs, प्रोटोकॉल के लिए नहीं पीबीएस संशोधित का उपयोग किया जाएगा.
- प्रत्येक ट्यूब करने के लिए, एक सेल धुंधला डाई, जोड़ने के DiI 5uM के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए. 10 सेकंड के लिए तुरंत भंवर. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर सेते हैं और प्रकाश में जोखिम से बचने.
- पीबीएस और स्पिन के साथ 1200 rpm पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों भरें.
- Centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला और मिलीलीटर प्रति वर्ष 40 मिलियन कोशिकाओं को पीबीएस में कोशिकाओं resuspend.
- 1 सीसी सीरिंज में एक 27G सुई (WT माउस को चूहों के लिए 5 सीरिंज के लिए 5 सीरिंज) के साथ 500 उल लोड. प्रत्येक काउहोट के लिए 6 सीरिंज तैयार यह विवेकपूर्ण हो सकता है. एक अतिरिक्त के रूप में जो हम करने के लिए अगले करने के लिए जा रहे हैं पूंछ नस इंजेक्शन मुश्किल हो सकता है है की मदद कर सकते हैं.
- कवर पन्नी के साथ सीरिंज क्रम में बिखरने से DiI रखने.
- प्रत्येक प्राप्तकर्ता जानवर में सेल मिश्रण के 500 उल इंजेक्षन, (प्रत्येक काउहोट के लिए 5).
- इन जानवरों को विकिरण के 9 Gy के साथ विकिरणित इंजेक्शन के लिए 4-24 घंटे पहले की जरूरत है.
- इंजेक्शन के बाद 48 घंटे, प्रत्येक प्राप्तकर्ता जानवर के हिंद अंग से फसल अस्थि मज्जा.
- प्रक्रिया के रूप में दाताओं के लिए ऊपर वर्णित. पीबीएस की 1 सीसी में प्रत्येक जानवर से कोशिकाओं Resuspend. एक सेल एक hemacytometer का उपयोग गिनती प्राप्त करते हैं.
- BD से LSR द्वितीय प्रवाह cytometer या एक बराबर साधन पर पढ़ें. परिणाम प्रतिशत या अस्थि मज्जा विश्लेषण कक्षों की निरपेक्ष संख्या में जो DiI सकारात्मक रहे हैं के रूप में व्यक्त किया जा सकता है.
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Discussion
घर वापस आना प्रक्रिया है जिससे स्टेम कोशिकाओं, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं, अस्थि मज्जा रक्त प्रवाह या चूहों के अस्थि मज्जा गुहा में इंजेक्शन के बाद किया जा रहा में अपनी तरह सहित अस्थि मज्जा की कोशिकाओं. के रूप में परिभाषा से स्पष्ट है, एक वैज्ञानिक hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं या immunophenotyping द्वारा की पहचान की है और सेल छँटाई के द्वारा अलग विभेदित कोशिकाओं के घर वापस आना अध्ययन के लिए चुना कर सकते हैं. आमतौर पर वैज्ञानिकों अस्थि मज्जा वंश मार्करों के लिए समाप्त कोशिकाओं इंजेक्षन और इसलिए पूर्वज और स्टेम कोशिकाओं के लिए समृद्ध है.
ब्याज की कोशिकाओं इंजेक्शन की खुराक इस प्रयोग में एक चर है. कक्षों की संख्या 500 से 000 प्रति प्राप्तकर्ता माउस प्राप्तकर्ता माउस के अनुसार 20 लाख भिन्न हो सकते हैं. और अधिक कोशिकाओं को एक अस्थि मज्जा में पता लगाने आसान इंजेक्षन कर सकते हैं. सेल संख्या उपलब्धता इंजेक्शन संख्या सीमित कर सकता है. 20 मिलियन LKS स्लैम कोशिकाओं छंटनी अत्यंत कठिन शायद सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स में मौजूदा प्रौद्योगिकियों, जो मामले में एक ऊपर दिए गए रेंज के निचले अंत की ओर कक्षों की एक नंबर का उपयोग करने का फैसला हो सकता है के साथ भी अव्यावहारिक है.
घर वापस आना जो में अध्ययन किया जा रहा है नली जानवर भी अलग किया जा सकता है. इस प्राप्तकर्ता जानवर WT C57BL/6J माउस जो lethally 9 विकिरण के grays के साथ विकिरणित किया गया है के रूप में हम इस प्रयोग WT C57BL/6J माउस या एक माउस डब्ल्यू / WV जो विकिरणित नहीं किया गया है में किया जा सकता है. चाहे माउस या विकिरणित सवाल experimenter के लिए जवाब की कोशिश कर रहा है पर नहीं निर्भर करता है. यदि एक एक सेटिंग जहाँ साइटोकिन्स की एक बड़ी राशि जारी किया जा रहा है और संवहनी रिसाव को प्रेरित किया जा रहा है में घर वापस आना अध्ययन में रुचि है, एक विकिरणित WT माउस एक उपयुक्त विकल्प है. कोशिकाओं (500 000) की एक छोटी संख्या एक WT माउस जो इतना ऊपर confounders के बिना नहीं है कि स्टेम सेल खाली niches के एक छोटी संख्या के लिए घर कर सकते हैं विकिरणित किया गया है में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है.
डब्ल्यू / WV चूहों सी किट रिसेप्टर समारोह में कमी कर रहे हैं और किसी भी शर्त के बिना स्टेम सेल टीका लगाना कर सकते हैं. यह हमें संवहनी चोट या cytokine रिलीज विकिरण की वजह से के अभाव में स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए घर वापस आना की अनुमति देता है. इन चूहों के उपयोग के साथ रसद समस्या यह है कि WWv चूहों की पर्याप्त संख्या प्रजनन कॉलोनी आकार चिंताओं की वजह से प्राप्तकर्ता के रूप में सेवा प्राप्त करने के लिए मुश्किल है.
संक्षेप में, यद्यपि हम एक मानक घर वापस आना प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, बदलाव के जवाब दिए और प्रयोग के डिजाइन के दौरान निर्धारित होना चाहिए होना प्रश्न पर निर्भर इस्तेमाल किया.
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Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और डॉ. डेविड Scadden की प्रयोगशाला में अनुकूलित. अनुदान दाना Farber कैंसर संस्थान / मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में क्लीनिकल रुधिर और कैंसर विज्ञान फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
