Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול המשמש ללימוד ביות של תאים hematopoietic אל נישות שלהם במח העצם.
Abstract
ביות היא תופעה לפיה התאים המושתלים hematopoietic מסוגלים לנסוע ו נקלטים או להקים מגורים במח העצם. Chemomkines שונים הקולטנים מעורבים ביות של בתאי גזע hematopoietic. [1, 2]
מאמר זה מתאר את פרוטוקול ביות הקלאסי שימוש במחקרים hematopoietic תא גזע. בדרך כלל זה כרוך לבודד את האוכלוסייה תא אשר הצרכים ביות להיחקר, מכתים אוכלוסייה זו עם צבע עניין הזרקת תאים אלה לתוך זרם הדם של חיה הנמען. החיה הנמען הקריב אז בזמן שנקבע מראש לאחר ההזרקה ואת מח העצם הערכה באחוז או מספר מוחלט של תאים אשר חיובי צבע של עניין. באחת תוכניות ניסיוניות הנפוצות ביותר, את היעילות ביות של תאים hematopoietic משתי חיות שונות גנטית (סוג חיה פרועה החוצה עקום המקביל) מושווה. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תא hematopoietic ביות במסגרת כגון הניסוי.
Protocol
- אנחנו מתחילים את הניסוי ביות על ידי מיצוי תאים שישמשו בניסוי. לצורך ניסוי זה הנוכחי אנו מעוניינים לגלות אם הביות של מוח העצם שלמה הגומחות בתוך העצמות הארוכות של חיות הנמען הוא שונה עבור תאים במח העצם המופק חיות WT כגון C57BL/6J (WT) לבין אלה מהונדס knockouts עבור קולטן Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO).
- לפני שנתחיל את הניסוי, אנו נאסוף את החומרים שאנו זקוקים לניסוי זה. במעבדה שלנו והניתוחים כל עכבר מתבצעות ברדס זרימה למינרית רקמות התרבות התאים במיוחד אם הם הולכים להיות הושתלו חיה הנמען במקום בשימוש לניתוח לשעבר vivo. אנחנו מתחילים על ידי הנחת יריעת כחול בתוך מכסה המנוע. אובייקטים אחרים הדרושים כוללים זוג מלקחיים וזוג מספריים חדים שהיו autoclaved, מטליות אזמל סטרילי ואלכוהול הפנויה. נצטרך PBS שונה וצלחת סטרילי 6 טוב, מרגמה, כחול העלי, 50cc עקף צינור חרוטי ומסנן הפנויה 70uM.
- אנחנו מתחילים על ידי לקיחת אחד ואחד WT עכבר KO.
- עכברים אלה מורדמים משאיפת CO 2 ואז טבול isopropranolol 70% למשך 5 שניות. פעולה זו מונעת זיהום של תאים בעלי עניין עם פרווה העכבר בידינו לא הוביל לכל פשרה בתשואה של תאים או תוצאות הניסוי.
- עכברים הם גזור ואז בתורו בעזרת זוג מלקחיים ומספריים חדים. בדרך כלל אנו מתחילים עם העכבר WT כעניין של שגרה. חיתוך קטן נעשה עור הגחון של העכבר המכסה את הבטן ואת העור נמתח ואז באמצעות הידיים. העור מגיע מן הגפיים האחוריות בקלות. עצם הירך לבין השוקה המחולצים אז נזהר שלא לעקור את ראש עצם הירך כמו זה מכיל כמות גדולה של מח עצם. הגפיים העליונות מנותקים הגוף של החיה, פשוט על ידי הפעלת כוח משיכה אליהם תוך שמירה על הגוף נייח. זה מסיר את הגפיים העליונות כמקשה אחת. Humeri המחולצים אז מן הגפיים העליונות.
- העצמות הוסרו ממוקמים שונה PBS אשר נוספה 6 צלחות היטב. השתנה PBS נעשית על ידי הוספת 2 מ"ל של סרום מומת חום שור עוברית ו 2 סמ"ק של EDTA 0.5 M pH8. פתרון זה מסונן אז דרך 0.45 Nalgene UM לסנן יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות.
- זה חיוני כדי התווית בארות בצלחת על מנת להיות מסוגל לזהות WT ועצמות KO כראוי.
- פגרי העכבר יוסרו מסולק משם.
- הגיליון החדש ממוקם מכסה המנוע עצמות מנקים בעזרת אזמל חד פעמיות.
- עצמות לנקות ממוקמים עכבר אחת בכל פעם במכתש. שני מ"ל שונה PBS מתווסף מרגמה ואת עצמות מרוסקות בעזרת העלי. חשוב שבר עצמות הראשון עם 10 קדימה ואחורה בתנועות של העלי ולאחר מכן לכתוש אותם עם תנועות סבובי מעגלית. בדרך כלל אני עושה 50 עם כיוון השעון, אז 50 תנועות נגד כיוון השעון וכך הלאה עד החומר שנשאר מרגמה הוא בצבע לבן ואת PBS שונה הוסיף החומר נשאר לבן או שקוף.
- אחרי כל סט של 50 תנועות מעגליות ריסוק, אנו מעבירים את הנוזל מתוך מרגמה אל UM 70 מסנן מונח על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. אל תשכחו להוסיף 2 מ"ל PBS על המדוכה לאחר העברת כל לסינון. אתה לא רוצה לנסות לכתוש העצמות היבשות או להשאיר אותם להתייבש במשך פרק זמן כלשהו כמו זה יוביל אפופטוזיס של תאים.
- לאחר החומר מרגמה הופך לבן, חומר במסנן מועבר מרגמה ואת ריסוק מתבצע שוב. הדבר מבטיח כי התאים לסנן אינם מבוזבזים. בדרך כלל זה לוקח אחת או שתי סדרות של תנועות סבובי חוזר שוב להכין את החומר הלבן מרגמה בצבע ובזמן החילוץ של תאים תושלם.
- הפתרון של צינור חרוטי הוא centrifuged עכשיו (יש לזכור לשמור את התאים מן WT וק.א. עכבר נפרדים. מכאן יהיה לך שני צינורות שונים (אחד עם תאים WT, שני תאים עם KO). צנטריפוגה בסל"ד 1200 למשך 10 דקות.
- לשאוב את supernatant באמצעות טפטפות aspirator נפרד עבור כל צינור. הוסף 2 סמ"ק של חיץ תמוגה ACK זה גלולה. זה חיץ תמוגה צריך להיות סטרילי. לדגור על הקרח במשך 5 דקות.
- הוסף 8 סמ"ק שונה של PBS על צינור אחד. קח 10 ul מהצינור כל טפטפת לתוך שתי בארות נפרד בצלחת 96 באר. מניחים את צינורות בצנטריפוגה ספין אותם 1200 סל"ד במשך 10 דקות.
- אמנם הצינורות הם ספינינג, להוסיף 30 ul של tryphan צבע כחול ו 60 ul שונה של PBS היטב בכל צלחת 96 היטב שנושאת את התאים של עניין.
- הוסף 10 ul מתערובת זו (נא ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה) כדי hemocytometer ולספור את התאים ארבעת הריבועים החיצוניים.
- ספירת תא מדגם לכל מ"ל הוא מספר תאים נספר ובכך מחולק 4 ו multiplieד 100 על ידי 000.
- לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר את הצינורות מן הצנטריפוגות ואת resuspend התאים PBS ללא מגנזיום, סידן, או גלוטמין L בריכוז של 20 מיליון תאים לכל מיליליטר. אתה צפוי להיות כ - 5 מ"ל נפח של WT ו 5 מ"ל של נפח עבור החיה KO. מכאן ואילך זה צעד אנחנו נהיה באמצעות PBS, לא שונה PBS עבור הפרוטוקול.
- כדי להוסיף צינור כל DiI, מכתים צבע התא, כדי להשיג ריכוז סופי של 5uM. וורטקס מיד למשך 10 שניות. לדגור על 37 מעלות למשך 10 דקות ו להימנע מחשיפה לאור.
- ממלאים את צינורות עם PBS ואת הספין במשך 10 דקות ב 1200 סל"ד.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התאים PBS ב 40 מיליון תאים לכל מיליליטר.
- טען ul 500 1 לתוך מזרקים סמ"ק עם מחט 27G (5 מזרקים עבור העכבר WT ו 5 מזרקים של עכברים KO). זה עשוי להיות נבון כדי להכין 6 מזרקים עבור כל קבוצה. לאחר אחד נוסף יכול לעזור כמו וריד הזנב זריקות שבו אנחנו הולכים לעשות עכשיו יכול להיות מסובך.
- מכסים את מזרקים בנייר על מנת לשמור על DiI מ מתפורר.
- להזריק 500 UL של התערובת לתוך התא החי כל נמען; (5 עבור כל קבוצה).
- בעלי חיים אלה צריכים להיות מוקרן עם 9 Gy הקרנה של 4-24 שעות לפני הזריקה.
- 48 שעות לאחר ההזרקה, מח עצם הקציר מן הגפיים האחוריות של כל חיה הנמען.
- תהליך כפי שתואר לעיל עבור התורמים. Resuspend את התאים מן החי כל 1 סמ"ק של PBS. השג לספור התא באמצעות hemacytometer.
- קרא cytometer LSR תזרים II מ BD או מכשיר מקביל. התוצאה יכולה להיות מבוטא באחוזים או המספר המוחלט של התאים במח העצם אשר ניתח חיובי DiI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביות הוא תהליך שבו תאים במח העצם, כולל בתאי גזע, תאים ובתאים הבדיל, דרכם לתוך מח העצם, לאחר שהוחדר לתוך זרם הדם או מח עצם של עכברים חלל. כאשר ברור מן ההגדרה, מדען יכול לבחור ללמוד את הביות של בתאי גזע hematopoietic, ובתאים או תאים מובחנים שזוהו על ידי immunophenotyping ומבודדים על ידי מיון התא. בדרך כלל המדענים מזריקים תאים במח העצם מדולדל עבור סמנים השושלת והעשירו ומכאן עבור אבי ותאי גזע.
המינון של התאים מוזרקים של הריבית הוא משתנה בניסוי הזה. מספר תאים יכול לנוע בין 500 ל 000 עכבר הנמען עד 20 מיליון דולר העכבר הנמען. התאים עוד אפשר להזריק קל יותר לאיתור במח העצם. מספר נייד זמינות עלולה להגביל את מספר מוזרק. מיון 20,000,000 LKS תאים SLAM קשה מאוד ואולי אפילו מעשי בטכנולוגיות הנוכחית הגדרות במעבדה ביותר, ובמקרה כזה אפשר להחליט להשתמש במספר התאים לקראת סוף התחתון של טווח לעיל.
החיה הצינור שבו ביות נחקרת גם יכול להיות מגוונות. זו חיה הנמען עשוי להיות עכבר C57BL/6J WT אשר כבר מוקרן קטלנית עם 9 אפורים של קרינה כפי שעשינו בניסוי הזה, עכבר C57BL/6J WT או עכבר W / WV אשר לא היה מוקרן. אם העכבר הוא מוקרן או לא תלויה בשאלה הנסיין מנסה לענות. אם מישהו מעוניין ללמוד ביות בסביבה שבה כמות גדולה של ציטוקינים המתפרסמת ו דליפה של כלי הדם מתבצעת המושרה, עכבר WT מוקרן הוא הבחירה המתאימה. מספר קטן יותר של תאים (500 000) ניתן להזריק עכבר WT אשר לא היה מוקרן כך שתאי גזע יכולים הביתה מספר קטן של נישות פנויים ללא לערפלנים לעיל.
W / WV עכברים חסרים בתפקוד הקולטן c-KIT והוא יכול נקלטים בתאי גזע ללא כל נפשית מראש. זה מאפשר לנו ללמוד את הביות של בתאי גזע בהעדר פגיעה בכלי הדם או לשחרר ציטוקינים הנגרמת על ידי קרינה. בעיה לוגיסטית עם השימוש של עכברים אלה היא כי קשה להשיג מספרי נאותה של עכברים WWv לשמש מקבלי בשל חששות המושבה רבייה גודל.
בקיצור, למרות שאנו מתארים ביות פרוטוקול סטנדרטי, וריאציות השתמשו תלויה בשאלה להיות ענה צריכה להיקבע במהלך תכנון הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרוטוקול זה נבדק אופטימיזציה במעבדה של ד"ר דוד Scadden. המימון ניתן על ידי מכון הסרטן דנה פרבר / החולים הכללי במסצ'וסטס קלינית להמטולוגיה ואונקולוגיה תוכנית עמיתי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
