非洲爪蟾卵母细胞的微量注射

Summary

在这里，我们展示了胞浆内显微注射的

Abstract

显微注射爪蟾卵母细胞超薄切片电子显微镜（EM）是一个优秀的系统研究核质运输。由于其庞大的核和核孔复合物（筹备）的高密度，核运输中可以很容易地在爪蟾卵母细胞的可视化。通过这个系统的使用（2006年盘特，审查）已获得很大的启示成核的进口和出口的机制。此外，我们用爪蟾卵母细胞显微注射剖析几种病毒的核进口途径，在宿主细胞核中复制。

这里我们展示了一个拥有核武器的进口基板的爪蟾卵母细胞胞浆内显微注射。我们还准备注入卵母细胞的可视化显示薄切片新兴市场，包括清扫，脱水和卵母细胞中嵌入环氧树脂嵌入树脂。最后，我们提供已显微注射的苜蓿californica nucleopolyhedrovirus杆状病毒（AcMNPV的）或小鼠（MVM）的细小分钟病毒的衣壳，并讨论该技术的潜在应用卵母细胞的代表性成果。

Protocol

第1部分：爪蟾卵母细胞显微注射的制备

1. 放置到一个50毫升锥形中的钙，免费修改巴特的生理盐水20毫升胶原酶的解决方案（5 mg / ml的胶原酶的试管一个爪蟾卵巢小片（约2厘米）：88 mM的氯化钠，1 mM的氯化钾，0.82 mM的_硫酸镁 ，10毫米HEPES，pH值7.5）。胶原酶用于去除环绕的卵母细胞的卵泡细胞。
2. 摇床平台上放置管，轻轻地摇动一小时（在100 RPM）。这个时间随不同的地段的胶原酶。因此，一小时后，一个小样本的卵母细胞，在解剖显微镜下研究。正常DE - folliculated卵母细胞应彼此分开，应该很容易将其插入到卵母细胞玻璃针。如果不充分去folliculated的卵母细胞，他们留在胶原酶溶液，并检查了一遍，每五分钟。
3. 洗净的卵母细胞与修改巴特的生理盐水（按揭证券化：88 mM的氯化钠，1 mM的氯化钾0.82 mM的硫酸镁_4，0.33 mM的钙（NO _3）2，0.41 mM的氯化钙_2，10毫米HEPES，pH值7.5）的三倍，和转让以一个100毫米直径的培养皿中含有按揭证券，另加1％青霉素/链霉素。现在已经准备好被显微注射的卵母细胞。如果将在另一天进行显微注射​​，储存长达一个星期的卵母细胞在4 ° C。
4. 使用解剖显微镜，选择成熟的阶段，六，卵母细胞显微注射。这些卵母细胞是大的，黑色的动物半球和南半球的奶油色的植物之间良好的对比度。
5. 六，卵母细胞的成熟阶段转移到一个微孔板（NUNC，以及体积10μL）。这项工作应仔细，使用吸管尖端已被切成末，允许不间断的卵母细胞吸200微升移液器。

第2部分： 爪蟾卵母细胞显微注射

1. 准备进口基材，加入少量的1％溴酚蓝，援助在显微注射的可视化显微注射。例如，我们添加1μL溴酚蓝10μL底物。
2. 广场上一个直径为100毫米的培养皿封口膜的小片，并免除的解决方案上的封口膜带注入5μL下降。
3. 被注入的解决方案，填写以前校准的注射针头的注入+ MATIC拖轮拉6.6μL微量德拉蒙德获得。对于这一点，微量愿望模式。要校准注射针头，针点标记每0.5毫米，对应的50 NL量。
4. 细胞质注射针尖插入一个卵母细胞在植物性半球，动物半球非常接近，在一个约45度角。转动的微量设置microinject，进口基材NL 50 microinject每个卵母细胞。针点的标记是用来监测量已注入基板。
5. 注入卵母细胞转移到一个小的（直径35毫米）的培养皿填充与按揭证券，并在室温孵化所需的时间量（时间点的选择，以便观察与NPC的相关进口基材，发生这种情况10至30分钟，正在积极向全国人民代表大会运输蛋白质和病毒，这一次也要看）注射部位和大小的蛋白质/病毒。
6. 当孵化完成后，转让的卵母细胞，以4毫升的玻璃小瓶，其中包含MBS 2％戊二醛，并固定在4℃过夜° C。

第3部分：夹层爪蟾卵母细胞

1. 第二天，洗卵母细胞与MBS的3倍。
2. 卵母细胞转移到一个小的培养皿中充满低盐缓冲（LSB：1毫米氯化钾， _氯化镁 2 0.5毫米，10毫米的HEPES，pH值7.5） 。使用解剖显微镜和解剖镊子，请从每个卵母细胞的植物极。它是有用的稳定解剖一个镊子的卵母细胞，而另一对是用于去除的植物极像剪刀。在这一点上是可能的，以评估在细胞质中的蓝色色调的存在显微注射成功。该协议是继续只对卵母细胞显微注射成功。此外，如果样本准备为少数族裔，这清扫步骤使得它更容易找到修整和切片的样品时，原子核。
3. 再次修复解剖的卵母细胞，在室温下1小时，用2％戊二醛的LSB。
4. 固定后，洗解剖的卵母细胞与LSB三次。

第4部分：嵌入和薄切片的EM注入卵母细胞的制备

1. 解剖卵母细胞转移到抑郁症的幻灯片。吸为液体作为POSsible，然后迅速（让他们不要干出来的）覆盖2％低熔点琼脂糖解剖的卵母细胞。虽然琼脂糖仍是软的，用一个吸头彼此分开的卵母细胞，以确保每一个卵母细胞是面临向上或向下（侧身）。
2. 允许琼脂糖巩固约10分钟。琼脂糖凝固后，用刀片切成小块，每个都包含一个解剖卵母细胞的琼脂糖。
3. 放置在一个4毫升的玻璃小瓶琼脂糖包埋的卵母细胞，修复后一小时在室温下用1％的官方机密条例“ _中的LSB 4。
4. 洗净样品在LSB的3倍。如果有必要，样品保存在4 ° C过夜，第二天继续协议。
5. 依序脱水（每次20分钟50，70，和90％的乙醇）的样品中的酒精升序系列。这是由两个100％的乙醇的变化，每次15分钟。 100％丙酮15分钟，最后脱水样本。
6. 1:1混合的EPON（Fluka公司）和丙酮为一小时2:1的EPON和丙酮的混合了两个小时，至少6个小时，终于在纯EPON通过渗透，渗透样品。
7. 充满了新鲜的纯EPON放置在平坦嵌入模具样品。卵母细胞在这样一种方式，面向细胞核注射部位接近方 - 方已解剖的卵母细胞 - 在这种情况下，将切片第一。这一步优化，可视化的选择基板的进口机会。
8. 最后，EPON的聚合两天在60 ° C
9. 为了形象化的样品，块修剪和使用ultramicrotome然后切片。部分转移到电磁电网，染色使用的标准程序，以及可视化与透射电子显微镜。，我们将不会显示这个协议的一部分，因为它是标准的 EM程序。

第5部分：代表性的成果：

如果该协议已获得成功，那么核信封（NE）和NPC应的EM显微照片清晰可见。根据在基板上注射，注射和固定之间的时间量，基板应在全国人民代表大会的细胞质面临中可见，全国人民代表大会，或在核面对全国人民代表大会。

图1显示了与（三）相邻的细胞质和细胞核（N）已注入杆状病毒AcMNPV的衣壳从爪蟾卵母细胞培养在4 ° C四小时，东北横截面，并嵌入和薄片处理新兴市场作为描述。箭头指向的NPC。在全国人大细胞质面对衣壳对接是一个白色箭头指示。

相比之下，图2显示了一个东北横截面，并与邻近的细胞质（C）和细胞核从已注射的小鼠细小分钟病毒（MVM）四个小时，在室温下孵育的爪蟾卵母细胞（ N）处理嵌入和新兴市场作为描述的薄片。使用这种技术，我们发现，MVM的诱导NE（Cohen和盘特，2005年）的中断。括号表示在NE的休息。箭头指向的NPC。假定与NE的MVM衣壳是由白色箭头指示。

图1：一个NE与相邻的细胞质（C）和细胞核（N）从爪蟾卵母细胞已注射杆状病毒AC MNPV衣壳，孵育4截面的电子显微镜° C为四个小时，并处理嵌入和薄片EM所述。箭头指向的NPC。衣壳是由白色箭头指示。比例尺：100纳米。

图2：一个NE与相邻的细胞质（C）和细胞核从已注射的小鼠细小分钟病毒（MVM）四个小时，在室温下孵育的爪蟾卵母细胞（N）的横截面的电子显微镜，处理嵌入和新兴市场作为描述的薄片。箭头指向的NPC。括号表示在NE的休息。假定与NE的MVM衣壳是由白色箭头指示。比例尺：100纳米。

Discussion

薄切片新兴市场相结合的爪蟾卵母细胞显微注射是一个非常有效的工具，为研究核质运输。已使用该系统，地图，通过全国人民代表大会不同的步骤，例如与细胞质的细丝和核篮（盘特，2006年审查），如全国人民代表大会的结构组成部分的核进口基板相互作用，进口。它也被用来研究核复制病毒的核进口（盘特和卡恩，2002年， 拉贝等人，2003 年 ，科恩和盘特，2005年） 。

这里显示的胞浆内显微注射技术的一个变体的核出口基板的核显微注射法等，1997）（盘特。要执行核注射，卵母细胞被放置在一个微孔板，导向，使动物极面对，并在4 ° C过夜培养。第二天，细胞核应作为一个微微凸起的地方，在动物极可见。细胞核显微注射用大约25 NL出口基板，在一个陡峭的角度（较大的45度）和嵌入和超薄切片电磁此处所述处理。

同样重要的是要注意处理与运输基板，是不能直接在电子显微镜下可见时，它往往是必要的标签与电子不透明的颗粒，如胶体金（2006年由盘特，审查）的基板的。