非洲爪蟾卵母细胞的微量注射

Summary

在这里，我们展示了胞浆内显微注射的非洲爪蟾卵母细胞的核进口基材，以及准备注入卵母细胞超薄切片电子显微镜可视化。

Abstract

显微注射爪蟾卵母细胞超薄切片电子显微镜（EM）是一个优秀的系统研究核质运输。由于其庞大的核和核孔复合物（筹备）的高密度，核运输中可以很容易地在爪蟾卵母细胞的可视化。通过这个系统的使用（2006年盘特，审查）已获得很大的启示成核的进口和出口的机制。此外，我们用爪蟾卵母细胞显微注射剖析几种病毒的核进口途径，在宿主细胞核中复制。

这里我们展示了一个拥有核武器的进口基板的爪蟾卵母细胞胞浆内显微注射。我们还准备注入卵母细胞的可视化显示薄切片新兴市场，包括清扫，脱水和卵母细胞中嵌入环氧树脂嵌入树脂。最后，我们提供已显微注射的苜蓿californica nucleopolyhedrovirus杆状病毒（AcMNPV的）或小鼠（MVM）的细小分钟病毒的衣壳，并讨论该技术的潜在应用卵母细胞的代表性成果。

Protocol

第1部分:爪蟾卵母细胞显微注射的制备

1. 放置到一个50毫升锥形中的钙，免费修改巴特的生理盐水20毫升胶原酶的解决方案（5 mg / ml的胶原酶的试管一个爪蟾卵巢小片（约2厘米）:88 mM的氯化钠，1 mM的氯化钾，0.82 mM的_硫酸镁 ，10毫米HEPES，pH值7.5）。胶原酶用于去除环绕的卵母细胞的卵泡细胞。
2. 摇床平台上放置管，轻轻地摇动一小时（在100 RPM）。这个时间随不同的地段的胶原酶。因此，一小时后，一个小样本的卵母细胞，在解剖显微镜下研究。正常DE - folliculated卵母细胞应彼此分开，应该很容易将其插入到卵母细胞玻璃针。如果不充分去folliculated的卵母细胞，他们留在胶原酶溶液，并检查了一遍，每五分钟。
3. 洗净的卵母细胞与修改巴特的生理盐水（按揭证券化:88 mM的氯化钠，1 mM的氯化钾0.82 mM的硫酸镁_4，0.33 mM的钙（NO _3）2，0.41 mM的氯化钙_2，10毫米HEPES，pH值7.5）的三倍，和转让以一个100毫米直径的培养皿中含有按揭证券，另加1％青霉素/链霉素。现在已经准备好被显微注射的卵母细胞。如果将在另一天进行显微注射​​，储存长达一个星期的卵母细胞在4 ° C。
4. 使用解剖显微镜，选择成熟的阶段，六，卵母细胞显微注射。这些卵母细胞是大的，黑色的动物半球和南半球的奶油色的植....

Discussion

薄切片新兴市场相结合的爪蟾卵母细胞显微注射是一个非常有效的工具，为研究核质运输。已使用该系统，地图，通过全国人民代表大会不同的步骤，例如与细胞质的细丝和核篮（盘特，2006年审查），如全国人民代表大会的结构组成部分的核进口基板相互作用，进口。它也被用来研究核复制病毒的核进口（盘特和卡恩，2002年， 拉贝等人，2003 年 ，科恩和盘特，2005年） 。

这里显示的胞浆内显微注射技术的一个变体的核出口基板的核显微注射法等，1997）（盘特。要执行核注射，卵母细胞被放置在一个微孔板，导向，使动物极面对，并在4 ° C过夜培养。第二天，细胞核应作为一个微微凸起的地方，在动物极可见。细胞核显微注射用大约25 NL出口基板，在一个陡峭的角度（较大的45度）和嵌入和超薄切片电磁此处所述处理。

同样重要的是要注意处理与运输基板，是不能直接在电子显微镜下可见时，它往往是必要的标签与电子不透明的颗粒，如胶体金（2006年由盘特，审查）的基板的。

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