Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Summary

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica di

Abstract

Microiniezione degli ovociti di Xenopus laevis seguita da sottile sezionamento microscopia elettronica (EM) è un sistema eccellente per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. A causa del suo nucleo di grandi dimensioni e ad alta densità di complessi poro nucleare (NPC), il trasporto nucleare può essere facilmente visibili nel ovociti di Xenopus. Di conoscere molto dei meccanismi di importazione ed esportazione nucleare è stata acquisita attraverso l'utilizzo di questo sistema (recensito da Pante, 2006). Inoltre, abbiamo utilizzato microiniezione degli ovociti di Xenopus di sezionare le vie importazione nucleare di diversi virus che si replicano nel nucleo ospitante.

Qui mostriamo la microiniezione citoplasmatica degli ovociti di Xenopus con un substrato importazione nucleare. Mostriamo anche la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento EM, tra cui la dissezione, disidratazione e inclusione degli ovociti in una resina epossidica embedding. Infine, mettiamo a disposizione dei risultati rappresentativi per ovociti che sono stati microiniettati con il capside del nucleopolyhedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o il virus Minuto parvovirus del Mouse (MVM), e discutere le potenziali applicazioni di questa tecnica.

Protocol

Parte 1: Preparazione di ovociti di Xenopus per microiniezione

1. Posizionare un piccolo pezzo (circa 2 cm) di ovaio Xenopus laevis in una da 50 ml tubo conico che contiene 20 ml di soluzione di collagenasi (5 mg / ml di collagenasi di calcio senza modifica di Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 Hepes mM, pH 7,5). Collagenasi viene utilizzata per rimuovere le cellule del follicolo che circondano gli ovociti.
2. Posizionare il tubo su una piattaforma shaker e rock delicatamente (a 100 RPM) per un'ora. Questa volta varia con diversi lotti di collagenasi. Così dopo un'ora, prendere un piccolo campione di ovociti e di esaminare sotto un microscopio da dissezione. Correttamente de-folliculated ovociti devono essere ben separati gli uni dagli altri, e dovrebbe essere facile per inserire un ago di vetro nel citoplasma dell'ovocita. Se gli ovociti non sono sufficientemente de-folliculated, sono lasciati nella soluzione di collagenasi e ricontrollato ogni cinque minuti.
3. Lavare gli ovociti tre volte con soluzione salina modificato Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM CaCl _2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e trasferirli per un piatto del diametro di 100 mm Petri contenenti MBS più 1% di penicillina / streptomicina. Gli ovociti sono ora pronti per essere microiniettati. Se microiniezione verrà eseguita in un altro giorno, conservare gli ovociti a 4 ° C per un massimo di una settimana.
4. Utilizzando un microscopio da dissezione, selezionare gli ovociti maturi fase VI per microiniezione. Questi ovociti sono grandi, con un buon contrasto tra l'emisfero animale nero e il color crema emisfero vegetali.
5. Trasferire il maturare ovociti VI tappa in una micropiastra (Nunc, 10 microlitri di volume bene). Questo dovrebbe essere fatto con cura, utilizzando una pipetta da 200 microlitri con un puntale che è stato tagliato alla fine di permettere undisrupted aspirazione degli ovociti.

Parte 2: microiniezione degli ovociti di Xenopus

1. Preparare il supporto all'importazione da microiniettati con l'aggiunta di una piccola quantità di 1% blu di bromofenolo, per facilitare la visualizzazione di microiniezione. Per esempio, si aggiunge 1 ml di blu bromofenolo a 10 ml di substrato.
2. Mettere una piccola striscia di Parafilm su un piatto di diametro 100 mm Petri, ed erogare un 5-microlitri goccia della soluzione da iniettare sulla striscia Parafilm.
3. Riempire un ago per iniezione precedentemente tarato (ottenuto tirando una 6,6 microlitri micropipetta Drummond con la Iniettare + Estrattore Matic) con la soluzione da iniettare. Per questo, il microinjector è impostato su modalità di aspirazione. Per calibrare l'ago dell'iniezione fare segni sul punto l'ago ogni 0,5 mm, che corrispondono ad un volume di 50 nl.
4. Per l'iniezione citoplasmatica, inserire la punta di un ago in un ovocita nell'emisfero vegetali, molto vicino alla emisfero animale, con un angolo di circa 45 gradi. Girare l'impostazione microinjector a microinject e microinject ogni ovocita con 50 nl di sottofondo importazione. I segni punto sul ferro sono usati per monitorare la quantità di substrato che è stato iniettato.
5. Trasferire gli ovociti iniettati di un piccolo (35-mm di diametro) Petri riempite con MBS, e incubare a temperatura ambiente per la quantità di tempo desiderato (punti di tempo sono scelti in modo da consentire l'osservazione del substrato importazione associati con gli NPC, ciò si verifica tra 10 e 30 minuti per le proteine ​​e per i virus che sono attivamente trasportati verso la NPC, questo tempo dipende anche dal sito di iniezione e la dimensione della proteina / virus).
6. Quando l'incubazione è completa, trasferire ovociti per un 4-ml, flaconcino di vetro contenente il 2% glutaraldeide in MBS, e fissare una notte a 4 ° C.

Parte 3: dissezione di ovociti di Xenopus

1. Il giorno dopo, lavare gli ovociti 3 volte con MBS.
2. Trasferimento ovociti ad una piccola scatola di Petri riempite con tampone iposodica (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl _2, 10 HEPES mM, pH 7,5). Utilizzando un microscopio da dissezione e dissezione pinzette, rimuovere il polo vegetale da ogni ovocita. E 'utile per stabilizzare l'ovocita viene sezionato con un paio di pinzette, mentre l'altra coppia è usato come forbici per rimuovere il palo vegetale. A questo punto è possibile valutare il successo della microiniezione dalla presenza di una sfumatura blu nel citosol. Il protocollo è continuata solo per gli ovociti che sono stati microiniettati successo. Inoltre, se i campioni devono essere preparati per EM, questo passo dissezione rende molto più facile trovare il nucleo durante il taglio e sezionamento dei campioni.
3. Fissare gli ovociti sezionato di nuovo con il 2% glutaraldeide in LSB per un'ora a temperatura ambiente.
4. Dopo la fissazione, lavare gli ovociti sezionato tre volte con LSB.

Parte 4: Preparazione di ovociti iniettati per incorporamento e EM sottile sezionamento

1. Trasferire gli ovociti sezionato a una diapositiva depressione. Aspirare la maggior quantità di liquido possibile, e poi rapidamente (in modo che non si seccano) coprono gli ovociti sezionato con il 2% agarosio a basso punto di fusione. Mentre l'agarosio è ancora morbido, l'uso di un puntale per separare gli ovociti gli uni dagli altri, e per assicurare che ogni ovocita è rivolto verso l'alto o verso il basso (non lateralmente).
2. Lasciare che il agarosio solidificare per circa 10 minuti. Una volta che l'agarosio si solidifica, usare una lama di rasoio per tagliare l'agarosio in piccoli pezzi, ciascuno dei quali contiene un ovocita sezionato.
3. Posizionare il agarosio-embedded ovociti in un 4-ml flacone di vetro, e li post-fix con l'1% OsO ₄ in LSB per un'ora a temperatura ambiente.
4. Lavare il campione tre volte in LSB. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C durante la notte e proseguire il protocollo il giorno successivo.
5. Sequenziale disidratano i campioni in una serie ascendente di alcool (50, 70, e 90% di etanolo per 20 minuti ciascuno). Questo è seguito da due cambiamenti in 100% etanolo per 15 minuti ciascuno. Infine disidratano campioni con 100% di acetone per 15 min.
6. Infiltrati campioni con una miscela 1:1 di Epon (Fluka) e acetone per un'ora, seguita da infiltrazione con una miscela 02:01 di Epon e acetone per due ore e, infine, in puro Epon per almeno sei ore.
7. I campioni in formelle piatto pieno di fresca pura Epon. Gli ovociti sono orientate in modo tale che il lato del nucleo più vicino al sito di iniezione - in questo caso la parte degli ovociti che è stato sezionato - sarà sezionato per primo. Questo passo ottimizza la possibilità di visualizzare l'importazione del substrato scelto.
8. Infine, polimerizzare il Epon per due giorni a 60 ° C.
9. Per visualizzare i campioni, i blocchi sono tagliati e poi sezionato con un ultramicrotomo. Le sezioni sono trasferiti su griglie di EM, macchiato con procedura standard, e visualizzati con un microscopio elettronico a trasmissione. Non mostrare questa parte del protocollo in quanto è procedura standard di EM.

Parte 5: Risultati Rappresentante:

Se il protocollo ha avuto successo, poi l'involucro nucleare (NE) e NPC dovrebbe essere chiaramente visibile in EM micrografie. A seconda del substrato e iniettato la quantità di tempo che intercorre tra l'iniezione e la fissazione, il substrato deve essere visibile la faccia citoplasmatica della NPC, nel NPC, o il volto nucleare della NPC.

La figura 1 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus AcMNPV, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per l'inclusione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Una docking capside la faccia citoplasmatica di un NPC è indicata da una freccia bianca.

Al contrario, la figura 2 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l'integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Utilizzando questa tecnica, abbiamo scoperto che MVM induce interruzioni del NE (Cohen e Pante, 2005). Parentesi indicano interruzioni nella NE. Frecce indicano i PNG. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche.

Figura 1: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus MNPV Ac, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per inclusione e sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Capsidi sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm.

Figura 2: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l'integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Parentesi indicano interruzioni nella NE. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm.

Discussion

Microiniezione degli ovociti di Xenopus combinato con sottili sezionamento EM è uno strumento altamente efficace per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. Questo sistema è stato utilizzato per mappare fasi distinte di importazione attraverso la NPC, per esempio l'interazione di un substrato di importazione nucleare con componenti strutturali della NPC, come i filamenti citoplasmatici e basket nucleare (recensito da Pante, 2006). E 'stato anche utilizzato per studiare il nucleare di importazione nucleare-replicante virus (Pante e Kann, 2002; Rabe et al, 2003;. Cohen e Pante, 2005).

Una variazione della tecnica microiniezione citoplasmatica mostrato qui è microiniezione nucleare di un substrato di esportazione nucleare (Pante et al., 1997). Per eseguire l'iniezione nucleare, gli ovociti vengono inseriti in una micropiastra, orientato in modo che i poli animale faccia in su, e incubate a 4 ° C durante la notte. Il giorno successivo, i nuclei dovrebbe essere visibile come una zona leggermente rialzata nel polo animale. I nuclei sono microiniettati con circa 25 nl di substrato esportazione a una ripida (più grande di 45 gradi) l'angolo e trattati per l'incorporamento e EM sottile sezionamento come descritto qui.

E 'anche importante notare che quando si tratta di un substrato di trasporto che non è direttamente visibile al microscopio elettronico, è spesso necessario per etichettare il substrato con un elettrone-opaco particella come l'oro colloidale (recensito da Pante, 2006).