アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Summary

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています

Abstract

薄切片電子顕微鏡（EM）に続いてアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための優れたシステムです。大きいため、大核と核膜孔複合体（NPCの）の高密度で、核輸送は、 アフリカツメガエル卵母細胞で容易に可視化することができます。核のインポートとエクスポートのメカニズムに多くの洞察は、このシステムの使用（Pantéによってレビュー、2006）によって得られている。さらに、我々は、ホストの核内で複製するいくつかのウイルスの核移入経路を分析するためにアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションを使用している。

ここでは、核移入基板とアフリカツメガエルの卵母細胞の細胞質マイクロインジェクションを示しています。我々はまた、解剖、脱水、およびエポキシ包埋樹脂に卵母細胞の埋め込みを含めて、EMを薄切片による可視化のために注入した卵母細胞の準備を示しています。最後に、我々はバキュロウイルスオートグラファカリフォルニの核多角体ウイルス （AcMNPV）またはマウス（MVM）のパルボウイルスの分のウイルスのキャプシドにマイクロインジェクションされた卵母細胞の代表的な結果を提供し、技術の潜在的なアプリケーションについて説明します。

Protocol

第1部：マイクロインジェクションのためのアフリカツメガエルの卵母細胞の調製

1. 88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMの：カルシウムを含まない修正バースの生理食塩水でコラゲナーゼ溶液（5 mg / mlのコラゲナーゼの20mlを含む50 mlのコニカルチューブにアフリカツメガエルの卵巣の小片（約2cm）を配置のMgSO _4、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）。コラゲナーゼは、卵母細胞を囲む卵胞細胞を除去するために使用されます。
2. シェーカーのプラットフォーム上にチューブを置き、一時間（100 RPMで）軽く揺らし。この時間は、コラゲナーゼの異なるロットによって異なります。こうして一時間後に、卵母細胞の小さなサンプルを取り、解剖顕微鏡下でそれらを調べる。適切にデfolliculated卵母細胞は、よく互いに分離されるべきであり、それは卵母細胞にガラス針を挿入する簡単なはずです。卵母細胞は、十分に脱folliculatedでない場合、それらはコラゲナーゼ溶液に残り、再び5分おきにチェックされます。
3. 修正されたバースの生理食塩水（MBS：88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMのMgSO _4を用い 、0.33 mMのカルシウム（NO _3）2、0.41 mMのCaCl _2を 、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）で卵母細胞を3回洗浄し、それらを転送するMBSプラス1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む100 mm径のシャーレに。卵母細胞は現在、微量注入する準備が整いました。マイクロインジェクションは、別の日に実行される場合、最大1週間までは4℃で卵母細胞を保存する。
4. 解剖顕微鏡を使って、マイクロインジェクションのための成熟期のVIの卵母細胞を選択する。これらの卵母細胞は、黒い動物半球とクリーミーな色の植物半球の間に良好なコントラストで、大規模です。
5. マイクロウェルプレート（Nunc社製、10μlを加えボリューム）に成熟した段階のVIの卵母細胞を移す。これは、卵母細胞のundisrupted吸引を可能にするために最後にカットされているピペットの先端に200μlのピペッターを使用して、慎重に行う必要があります。

第2部： アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

1. マイクロインジェクションの可視化を支援するために、1％ブロモフェノールブルーを少量添加することにより微量注入するインポートの基板を準備します。例えば、我々は、基板を10μlにブロモフェノールブルーを1μl加える。
2. 100 mm径のシャーレ上にパラフィルムの小さなストリップを配置し、パラフィルムストリップに注入する液の5μlのドロップを分注する。
3. 注入される溶液で以前に校正された注射針を（注入+マチックプラーと6.6μlのマイクロピペットドラモンドを引いて得られる）埋める。このため、インジェクターを吸引モードに設定されています。注射針を校正するには、針を50 NLのボリュームに対応するすべての0.5mmの、ドットマークを作る。
4. 細胞質注入の場合は、約45度の角度で、動物半球に非常に近い、植物半球の卵母細胞に針の先端を挿入する。顕微注入するために微量注入器の設定をオンにして、輸入材の50 NLで各卵母細胞を顕微注入する。針で、濁点が注入された基質の量を監視するために使用されています。
5. NPCに関連付けられている輸入材の観察を可能にするように時間のポイントがそのように選択されているMBSで満たされた小さな（35mmの直径）ペトリ皿に注入した卵母細胞を移し、そして時間の所望の量（室温でインキュベートする、これが発生します。タンパク質のため、積極的にNPCに向かって輸送されるウイルスの10分から30分、この時間にも）注射の部位とタンパク質/ウィルスのサイズによって異なります。
6. インキュベーションが完了すると、MBSで2％グルタルアルデヒドを含む4 mlのガラスバイアルに卵母細胞を移し、4℃で一晩固定し℃、

パート3： アフリカツメガエル卵母細胞の解剖

1. 次の日、MBSで卵母細胞を3回洗浄。
2. 低塩緩衝液（1 mMの塩化カリウム、0.5 mMのMgCl _2、10mMのHEPES、pH7.5のLSB）で満たされた小さなペトリ皿に卵母細胞を移す。解剖顕微鏡と解剖ピンセットを使用して、それぞれの卵母細胞から植物極を削除します。他のペアは、植物極を削除するには、はさみのように使用されている間は、ピンセットの一組で解剖されている卵母細胞を安定化するのに便利です。この時点では、細胞質ゾルで青みの存在によってマイクロインジェクションの成功を評価することが可能です。プロトコルは、成功微量注入した卵母細胞のために継続しています。サンプルはEMのために準備される場合に加えて、、この解剖のステップは、サンプルのトリミングとセクショニング時に核を見つけるのがかなり容易になります。
3. 室温で1時間のLSBの2％グルタルアルデヒドで再切除した卵母細胞を修正。
4. 固定後、LSBで解剖卵母細胞を3回洗浄する。

パート4：埋め込みとEMをシンセクショニングの注入した卵母細胞の調製

1. うつ病のスライドに切除した卵母細胞を移す。 POSなどの液体をできるだけ多く吸引（彼らが乾燥しないように）すぐにその後ルヘ、および2％低融点アガロースで切除した卵母細胞をカバー。アガロースはまだ柔らかいですが、お互いから卵母細胞を分離するためにピペットチップを使用し、それぞれの卵母細胞が（ではない横）表向きにしているか停止していることを確認してください。
2. アガロースは、約10分間固化することができます。アガロースが固化したら、それぞれ含むもの解剖卵母細胞、小さい部分にアガロースをカットするカミソリの刃を使用してください。
3. 室温で1時間、LSBの1％OSO ₄でアガロース包埋の4ミリリットルガラスバイアルに卵母細胞、および後処理を修正して置きます。
4. サンプルのLSBで3回洗浄する。必要に応じて、℃で一晩4℃でサンプルを保存し、翌日プロトコルを続ける。
5. 順次（20分毎に50、70、および90％エタノール）アルコールの昇順シリーズでサンプルを脱水する。これは、15分ごとに100％エタノールで2つの変化が続いている。最後に15分間、100％アセトンでサンプルを脱水する。
6. 少なくとも6時間、純粋なエポンで最終的に2時間エポンとアセトンの2:1混合物で浸潤が続く、一時間エポンの1:1混合物（フルカ）を有​​するサンプルとアセトンを浸透させる、と。
7. 新鮮な純粋なエポンで満たされた平らな埋め込み型の場所のサンプル。卵母細胞は、注射部位に近い核の側面のような方法で向いている - このケースで解剖された卵母細胞の側は、 - 最初の切片となる。このステップは、選択された基板の輸入を可視化するチャンスを最適化します。
8. 最後に、60℃で二日間エポンを重合℃に
9. サンプルを可視化するために、ブロックをトリミングしてから、ウルトラミクロトームを用いて区分されています。セクションは、EMグリッド上に移し、標準的な手順を用いて染色し、透過型電子顕微鏡で可視化されています。 それは標準的なEMの手続きであるとして、我々は、プロトコルのこの部分が表示されません 。

パート5：代表的な結果：

プロトコルが成功している場合には、核膜（NE）とNPCはEM顕微鏡写真ではっきりと見えるはずです。注入材と注入と固定の間の時間の量に応じて、基板はNPCで、またはNPCの核顔で、NPCの細胞質面で見えるはずです。

図1は、4時間、4℃でインキュベートバキュロウイルスAcMNPVのキャプシドを注入されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（n）は、ある断面NE、および埋め込 ​​みと薄切片用に処理を示しています。 EMは、説明。矢じりは、NPCに指す。 NPCの細胞質面でのカプシドドッキングは、白い矢印で示されます。

対照的に、図2は、4時間室温でインキュベートしたマウスのパルボウイルスミニッツウイルス（MVM）、を注射されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（N）と断面NEを示し、埋め込みとEMは前述のように薄いセクションのために処理。このテクニックを使用して、我々は、MVMはNE（コーエンとPanté、2005年）の混乱を引き起こすことを発見した。括弧は、NEで休憩を示している。矢じりは、NPCに指す。 NEに関連付けられている推定上のMVMのキャプシドは、白い矢印で示されている。

図1：4時間Cは4℃でインキュベートし、バキュロウイルスAC MNPVのキャプシドを注射し、用に処理されたアフリカツメガエル卵母細胞から北東に隣接する細胞質とのクロスセクション（c）と核（N）の電子顕微鏡写真埋め込みとEMは前述のように薄いセクション。矢じりは、NPCに指す。キャプシドは、白い矢印で示されている。スケールバー：100nmである。

図2：4時間室温でインキュベートしたマウスのパルボウイルスミニッツウイルス（MVM）、を注射されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（N）とNEの断面の電子顕微鏡写真、および埋め込みとEMは前述のように薄いセクションのために処理。矢じりは、NPCに指す。括弧は、NEで休憩を示している。 NEに関連付けられている推定上のMVMのキャプシドは、白い矢印で示されている。スケールバー：100nmである。

Discussion

薄切片EMと組み合わせ、アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための非常に効果的なツールです。このシステムは、細胞質フィラメントおよび核バスケット（Panté、2006年までにレビューさ）のようなNPCの構造部品と核移入基板の例の作用については、NPCを通じて輸入の明確なステップをマッピングするために使用されています。また、核複製ウイルスの核移入を（;レーブら、2003;。コーエンとPanté、2005 Pantéとカン、2002）の研究に使用されています。

ここに示されている細胞質マイクロインジェクション技術の一つのバリエーションは、核外輸送の基質（Panté ら 、1997）の核マイクロインジェクションです。核注入を実行するには、卵母細胞は、動物極が上直面するように配向、マイクロウェルプレートに入れ、そして4℃で一晩インキュベートする。次の日、核が動物極にわずかに隆起領域として表示されるはずです。核が急（45度より大きい）角度で輸出基板の約25 NLでマイクロインジェクションし、EMがここで説明するように切片薄埋め込みとするために処理されます。

電子顕微鏡下で直接に表示されていない場合、トランスポート基板を扱うとき、それはしばしばこのようなコロイド金（Panté、2006年までにレビューさ）のような電子不透明な粒子を基板にラベルを付ける必要があることに注意することも重要です。