Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Summary

Här visar vi cytoplasmiska mikroinjektion av

Abstract

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter följt av tunna sektionering elektronmikroskopi (EM) är ett utmärkt system för att studera nucleocytoplasmic transporter. På grund av dess stora kärnan och hög täthet av nukleära porer komplex (NPC), kan kärntransport enkelt visualiseras i Xenopus äggcellen. Mycket insikt i de mekanismer av kärnvapen import och export har fått genom att använda detta system (granskats av Pante, 2006). Dessutom har vi använt mikroinjektion av Xenopus äggceller att dissekera den nukleära import vägar av flera virus som replikerar i den mottagande kärnan.

Här kan vi visa cytoplasmiska mikroinjektion av Xenopus oocyter med en nukleär import substrat. Vi visar också beredningen av det injicerade ägg för visualisering genom tunn-sektionering EM, inklusive dissektion, uttorkning, och inbäddning av oocyter i en epoxi bädda harts. Slutligen ger vi representativa resultat för ägg som har idag injiceras med kapsid av baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) eller parvovirus minuten virus Möss (MVM), och diskutera möjliga tillämpningar av tekniken.

Protocol

Del 1: Förberedelse av Xenopus oocyter för mikroinjektion

1. Placera en liten bit (ca 2 cm) av Xenopus laevis äggstock i en 50 ml E-rör som innehåller 20 ml kollagenas lösning (5 mg / ml kollagenas på kalcium-fri modifierad Barth saltlösning: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mm Hepes, pH 7,5). Kollagenas används för att avlägsna follikeln celler som omger oocyter.
2. Placera röret på en shaker plattform och rock försiktigt (vid 100 rpm) i en timme. Denna tid varierar med olika massor av kollagenas. Således efter en timme, ta ett litet urval av äggceller och granska dem under en dissekera mikroskop. Korrekt de-folliculated oocyter bör vara väl separerade från varandra, och det ska vara enkelt att sätta in ett glas nål i äggcellen. Om oocyter inte är tillräckligt de-folliculated, de är kvar i kollagenas lösningen och kontrollerats på nytt var femte minut.
3. Tvätta oocyter tre gånger med modifierad Barth saltlösning (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mm Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM CaCl _2, 10 mm Hepes, pH 7,5), och överföra dem till en 100-mm petriskål med MBS plus 1% penicillin / streptomycin. De oocyter är nu redo att idag injiceras. Om mikroinjektion kommer att utföras på en annan dag, lagra oocyter vid 4 ° C i upp till en vecka.
4. Med hjälp av en dissekera mikroskop, välj mogna äggceller skede VI för mikroinjektion. Dessa ägg är stora, med bra kontrast mellan det svarta djuret halvklotet och den krämiga-färgade vegetabiliska halvklotet.
5. Överför mogna oocyter scenen VI i en mikrobrunnsplattan (Nunc, 10 l och volym). Detta bör göras noggrant, med hjälp av en 200-l pipett med en pipettspets som skurits i slutet för att möjliggöra störningsfri sugning av oocyter.

Del 2: mikroinjektion av Xenopus oocyter

1. Förbered import substratet som idag injiceras genom att tillsätta en liten mängd 1% bromfenolblått, till stöd i visualisering av mikroinjektion. Till exempel lägger vi en ìl bromfenolblått till 10 ìl av substrat.
2. Placera en liten remsa av Parafilm på en 100-mm petriskål, och fördela en 5-l droppe av lösning som skall injiceras på Parafilm remsan.
3. Fyll en tidigare kalibrerad injektionsnål (erhålls genom att dra en 6,6-l mikropipett Drummond med Injicera + Matic Avdragare) med den lösning som skall injiceras. För detta är microinjector inställt på aspiration läge. För att kalibrera injektionsnålen göra färgmarkering på nål varje 0,5 mm, vilket motsvarar en volym på 50 nl.
4. För cytoplasmiska injektion, in spetsen av nålen i en äggcell i vegetabilisk halvklotet, mycket nära djuret halvklotet, på en cirka 45 graders vinkel. Vrid microinjector inställningen till microinject och microinject varje äggcell med 50 NL import substrat. Punkten märken på nålen används för att övervaka hur mycket substrat som har injicerats.
5. Överför den injicerade ägg till en liten (35-mm diameter) petriskål fylld med MBS, och inkubera vid rumstemperatur för önskad tid (tidpunkter är valda så att observation av import substrat i samband med NPC: er, detta sker mellan 10 och 30 minuter för proteiner och för virus som aktivt transporteras mot NPC, denna gång beror också på injektionsstället och storleken av det protein / virus).
6. När inkubationen är klar, överföra äggceller till en 4-ml injektionsflaska av glas innehållande 2% glutaraldehyd i MBS och fixa över natten vid 4 ° C.

Del 3: dissekering av Xenopus oocyter

1. Nästa dag, tvätta ägg 3 gånger med MBS.
2. Överför oocyter till en liten petriskål fylld med låg salt-buffert (LSB: 1 mm KCl, 0,5 mM MgCl _2, 10 mm HEPES, pH 7,5). Med hjälp av en dissekera mikroskop och dissekera pincett, ta bort vegetabiliskt stolpe från varje äggcell. Det är nyttigt att stabilisera äggcellen som dissekeras med ett par pincett, medan det andra paret används som en sax för att ta bort vegetabiliska polen. Vid denna tidpunkt är det möjligt att utvärdera framgången med mikroinjektion av förekomsten av en blå nyans i cytosolen. Protokollet är fortsatt bara för de ägg som idag injiceras framgångsrikt. Dessutom, om proverna vara beredd på EM, gör denna dissektion steg är det mycket lättare att hitta kärnan Vid trimning och snittning proverna.
3. Fäst dissekerade ägg igen med 2% glutaraldehyd i LSB i en timme vid rumstemperatur.
4. Efter fixering, tvätta dissekerade oocyter tre gånger med LSB.

Del 4: Beredning av Injected oocyter för inbäddning och Thin-Sektionering EM

1. Överför dissekerade ägg till en depression bild. Aspirera så mycket av vätskan som möjligtmöjligt, och sedan snabbt (så att de inte torkar ut) täcka dissekerade ägg med 2% lågsmältande agaros. Medan agarosen är fortfarande mjukt, använd en pipettspets att separera ägg från varandra och att säkerställa att varje äggcell är vänd upp eller ner (inte åt sidan).
2. Låt agarosen stelna i ca 10 minuter. När agarosen stelnar, använda ett rakblad att skära agaros i små bitar, var och en innehåller ett dissekerat äggcellen.
3. Placera agarosen-inbäddade ägg i en 4-ml injektionsflaska av glas, och efter fäst dem med 1% Oso ₄ i LSB i en timme vid rumstemperatur.
4. Tvätta provet tre gånger i LSB. Om det behövs, förvara provet vid 4 ° C över natten och fortsätta protokollet nästa dag.
5. Sekventiellt torka proverna i en stigande serie av alkohol (50, 70 och 90% etanol i 20 minuter vardera). Detta följs av två förändringar i 100% etanol i 15 min vardera. Slutligen torka prover med 100% aceton i 15 min.
6. Infiltrera prover med en 1:1 blandning av Epon (Fluka) och aceton i en timme, följt av infiltration med en 2:1 blandning av Epon och aceton i två timmar, och slutligen i ren Epon i minst sex timmar.
7. Placera proven i platta bädda formar fyllda med färska ren Epon. De oocyter är orienterade på ett sådant sätt att den sidan av kärnan närmare injektionsstället - i detta fall den sida av oocyter som har dissekerat - kommer att sektioneras först. Detta steg optimerar chansen att visualisera import av de utvalda substrat.
8. Slutligen Polymerisera Epon i två dagar vid 60 ° C.
9. För att visualisera proverna är blocken trimmas och sedan snittades med hjälp av en ultramicrotome. Avsnitten är överförs till EM nät, färgade med vanliga förfarandet, och visualiseras med ett transmissionselektronmikroskop. Vi kommer inte att visa denna del av protokollet som det är standard EM förfarande.

Del 5: representativa resultat:

Om protokollet har varit framgångsrik, då kärnhöljet (NE) och NPC: er ska vara klart synliga i EM micrographs. Beroende på underlaget injiceras och tiden mellan injektion och fixering bör underlaget vara synliga på cytoplasmiska ansikte NPC, i NPC, eller på den nukleära sidan av NPC.

Figur 1 visar en NE tvärsnitt med intilliggande cytoplasma (C) och kärnan (n) från en Xenopus äggcell som har injicerats med capsids av baculovirus AcMNPV, ruvade vid 4 ° C i fyra timmar, och bearbetas för inbäddning och tunna avsnitt EM beskrivas som. Pilspetsar punkt till NPCs. En kapsid dockning vid cytoplasmiska ansiktet av en NPC indikeras av en vit pil.

Däremot visar figur 2 en NE tvärsnitt med intilliggande cytoplasma (C) och kärnan (n) från en Xenopus äggcell som har injicerats med parvovirus minuten virus Möss (MVM), inkuberas i rumstemperatur i fyra timmar, och behandlas för inbäddning och tunna avsnitt EM som beskrivs. Med denna teknik har vi funnit att MVM inducerar störningar i NE (Cohen och Pante, 2005). Parentes anger avbrott i NE. Pilspetsar punkt till NPCs. Förmodade MVM capsids samband med NE markeras med vita pilar.

Figur 1: Electron mikroskop av en NE tvärsnitt med intilliggande cytoplasma (C) och kärnan (n) från en Xenopus äggcell som har injicerats med capsids av baculovirus Ac MNPV, ruvade vid 4 ° C i fyra timmar, och behandlas inbäddning och tunn avsnitt EM beskrivas som. Pilspetsar punkt till NPCs. Capsids markeras med vita pilar. Skala bar: 100 nm.

Figur 2: Electron mikroskop av en NE tvärsnitt med intilliggande cytoplasma (C) och kärnan (n) från en Xenopus äggcell som har injicerats med parvovirus minuten virus Möss (MVM), inkuberas i rumstemperatur i fyra timmar, och behandlas för inbäddning och tunna avsnitt EM som beskrivs. Pilspetsar punkt till NPCs. Parentes anger avbrott i NE. Förmodade MVM capsids samband med NE markeras med vita pilar. Skala bar: 100 nm.

Discussion

Mikroinjektion av Xenopus oocyter i kombination med tunna sektionering EM är ett mycket effektivt verktyg för att studera nucleocytoplasmic transporter. Detta system har använts för att kartlägga olika steg av import via NPC, till exempel samspelet mellan en nukleär import substrat med strukturella komponenter i den nationella folkkongressen, såsom cytoplasmiska filament och kärnkraft korg (granskats av Pante, 2006). Det har också använts för att studera det nukleära import av kärnvapen replikera virus (Pante och Kann, 2002; Rabe et al, 2003;. Cohen och Pante, 2005).

En variant av cytoplasmisk mikroinjektion tekniken som visas här är kärnkraft mikroinjektion av en kärnteknisk export substrat (Pante et al., 1997). För att utföra kärn-injektion, är ägg placeras i en mikrobrunnsplattan, orienterade så att djuret polerna uppåt, och inkuberas vid 4 ° C över natten. Nästa dag ska atomkärnor synas som en liten förhöjning i djuret stolpen. De kärnor idag injiceras med cirka 25 NL export substrat på en brant (större än 45-grader) vinkel och behandlas för inbäddning och tunna sektionering EM som beskrivs här.

Det är också viktigt att notera att när det handlar om en transport substrat som inte är direkt synliga under elektronmikroskop, är det ofta nödvändigt att märka underlaget med en elektron-ogenomskinlig partikel som kolloidalt guld (granskats av Pante, 2006).