Summary
Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.
Abstract
O
Protocol
Antes de começar a
- Prepare as seguintes soluções: PBT (0,1% Triton X100 em 1X PBS), PBTB (0,2% BSA em PBT), e PBTN (NGS 2% em PBTB).
- Dissecar as larvas Drosophila. Consulte Drosophila larval Dissection MNJ.
Imuno-histoquímica
- Mover as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo PBT. Lavar as larvas duas vezes por 15 minutos no PBT. Nota: para lavar, coloque o tubo de 1,5 ml em um misturador nutator. Remover o líquido com um pippetor e substituí-lo com o líquido fresco.
- Remover o PBT. Lave em PBTB duas vezes por 30 minutos.
- Remover o PBTB. Lave em PBTN duas vezes por 15 minutos.
- Incubar em anticorpo primário diluído em PBTN à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 º C durante a noite.
- Enxágüe duas vezes com PBTB. Nota: a Solução de lavagem de adicionar e remover rapidamente.
- Lavar duas vezes por 15 minutos em PBTB.
- Lave em PBTN por 30 minutos.
- Incubar em anticorpo secundário (anticorpo primário e conjugado se você estiver usando uma) diluído em PBTN.
- Capa em papel alumínio e incubar por 1,5 horas em temperatura ambiente.
- Enxágüe duas vezes com PBTB.
- Lavar duas vezes durante 15 minutos com PBTB.
- Proceder à montagem.
Montagem
Nota: Monte em glicerol se as amostras vão ser trabalhada imediatamente. Montagem em ouro Prolong se as amostras serão armazenadas antes de imagem (para mais de uma semana) ou se as amostras devem ser fotografada várias vezes. Para usar, coloque uma garrafa de prolongar em 65 º banho de água C por 2-3 minutos. Tomar uma alíquota de Prolong Ouro e manter-se em uma fonte de calor bloco de 45-50 º C.
- Despeje preps coradas em PBT em um vidro de relógio.
- Ponha um pouco de glicerol em uma lâmina de vidro limpa para processamento.
- Move os animais para o processamento de slides, escolhendo-os fora do vidro de relógio por um canto com a pinça. Garantir que eles estão lado cutícula para baixo.
- Retire a cabeça ea cauda com uma lâmina de barbear fresco na lâmina de vidro de processamento. Um exacto faca com lâmina # 16 funciona bem para isso.
- Em outro slide (montagem de slides), coloque uma pequena gota de glicerol / prolongar e espalhá-lo com uma pinça limpa.
- Mover os animais dissecados para a montagem de carros por sua borda, tomando cuidado para não inverter-los. Tentar montá-los em linhas na mesma orientação. Monte 6-8 animais por slide.
- Queda de um deslizamento de capa sobre colocando uma vantagem para o glicerol / Prolong e lentamente liberá-lo.
- Seal o slide com esmalte de unha. [Nota Não imagem até que o verniz está seco. Isso normalmente leva 10 minutos. Para amostras montado em prolongar a ouro, deixe os slides secar por pelo menos três horas antes de selagem ou de imagem.]
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Discussion
Imuno-histoquímica (IHQ) é vital para o estudo da biologia MNJ, pois permite a visualização do MNJ. Isto é conseguido usando anticorpos que reconhecem a membrana neuronal (por exemplo, HRP), o presynapse (por exemplo, CSP, SYT), e / ou o postsynapse (por exemplo, DLG). Moléculas sinalizadoras, proteínas estruturais, ou novas proteínas de interesse também pode ser manchada. Então, os genes podem ser mutado ou missexpressed e IHC pode detectar perturbação da estrutura sináptica e / ou de sinalização neuronal.
O MNJ de Drosophila ganhou grande popularidade desde os estudos iniciais que iluminou a sua estrutura básica ea função. 1-4 Muitas das moléculas que têm sido identificadas em estudos do MNJ Drosophila são conservadas em vertebrados. 4 Portanto, as percepções aprendidas através de estudos do MNJ Drosophila pode ser aplicável a biologia sináptica em muitos sistemas. Algumas aplicações possíveis incluem o estudo de moléculas envolvidas no desenvolvimento sináptico, plasticidade, e doenças neurológicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
