Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie Immunhistochemie auf seziert Drosophila Larve führen.
Abstract
Die
Protocol
Bevor Sie beginnen
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen: PBT (0,1% Triton X100 in 1X PBS), PBTB (0,2% BSA in PBT) und PBTN (2% NGS in PBTB).
- Dissect Drosophila-Larven. Bitte beachten Sie Drosophila Larven NMJ Dissection.
Immunhistochemie
- Bewegen sich die Larven in ein 1,5 ml Röhrchen mit PBT. Waschen Sie die Larven zweimal für 15 Minuten in der PBT. Hinweis: um sich zu waschen, statt der 1,5-ml-Tube auf einem Kolbenpendel Mischer. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem pippetor und ersetzen sie durch frische Flüssigkeit.
- Entfernen Sie die PBT. Wash in PBTB zweimal für 30 Minuten.
- Entfernen Sie die PBTB. Wash in PBTN zweimal für 15 Minuten.
- Inkubieren in Primärantikörper in PBTN bei Raumtemperatur verdünnt für 1 Stunde oder bei 4 º C über Nacht.
- Spülen Sie zweimal mit PBTB. Hinweis: Um hinzuzufügen Lösung spülen und entfernen schnell.
- Zweimal waschen für 15 Minuten in PBTB.
- Wash in PBTN für 30 Minuten.
- Inkubieren in Sekundär-Antikörper (und konjugierte Primärantikörper, wenn Sie eines verwenden) in PBTN verdünnt.
- Cover in Alufolie und Inkubation für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie zweimal mit PBTB.
- Zweimal waschen für 15 Minuten mit PBTB.
- Gehen Sie zur Montage.
Montage
Hinweis: Mount in Glycerin, wenn die Proben sofort abgebildet werden. Berg in Prolong Gold-, wenn die Proben vor der Belichtung gespeichert werden soll (für mehr als eine Woche) oder, wenn die Proben müssen mehrfach abgebildet werden. Um zu verwenden, statt eine Flasche zu verlängern, 65 º C Wasserbad für 2-3 Minuten. Nehmen Sie ein Aliquot verlängern Gold und halten in einer Wärme-Block bei 45-50 º C.
- Gießen gefärbt preps in PBT in einem Uhrglas.
- Legen Sie einige Glycerin auf einen sauberen Glasobjektträger für die Verarbeitung.
- Bewegen Sie den Tieren auf die Verarbeitung von Bild Kommissionierung sie aus dem Uhrglas durch eine Ecke mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, sie sind Kutikula nach unten.
- Entfernen Sie den Kopf und Schwanz mit einer frischen Rasierklinge auf die Bearbeitung von Glas gleiten. Ein exacto-Messer mit Klinge Nr. 16 eignet sich gut dafür.
- Auf einem anderen Bild (Montage Folie), legte einen kleinen Tropfen Glycerin / verlängern und breitete sie mit sauberen Pinzette.
- Bewegen Sie den sezierten Tiere an der Montageplatte schieben durch ihre Kante, kümmert sich nicht um sie zu invertieren. Versuchen Sie, sie in Reihen in der gleichen Ausrichtung zu montieren. Berg 6-8 Tieren pro Folie.
- Drop ein Deckglas auf, indem eine Kante in die Glycerin / Verlängern und langsam loslassen.
- Verschließen Sie die Folie mit Nagellack. Hinweis [Nicht Bild, bis der Lack trocken ist. Dies dauert in der Regel 10 Minuten. Für die Proben in Verlängerung Gold montiert, lassen Sie die Folien trocken für mindestens drei Stunden vor dem Versiegeln oder Bildgebung.]
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Discussion
Immunhistochemie (IHC) ist von entscheidender Bedeutung für das Studium der Biologie, weil es NMJ Visualisierung der NMJ ermöglicht. Dies wird durch die Verwendung von Antikörpern, dass die neuronalen Membran (zB HRP), der Präsynapse (zB CSP, SYT), und / oder die Postsynapse (zB DLG) erkennen erreicht. Signalmoleküle, Strukturproteine, oder neuartige Proteine von Interesse kann auch gefärbt werden. Dann können Gene mutiert oder missexpressed werden, und IHC können Störung der synaptischen Struktur und / oder neuronalen Signalübertragung zu erkennen.
Die NMJ von Drosophila hat große Popularität seit den frühen Studien, dass die grundlegende Struktur und Funktion beleuchtet gewonnen. 1-4 Viele der Moleküle, die in Studien der Drosophila NMJ identifiziert wurden bei Wirbeltieren konserviert sind. 4 Darum lernten die Erkenntnisse durch Studien der Drosophila NMJ könnten erhoben werden, um synaptische Biologie in vielen Systemen. Einige mögliche Anwendungen sind die Untersuchung von Molekülen in synaptischen Entwicklung, Plastizität und neurologischen Erkrankung beteiligt sind.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
