Summary
此协议表明如何执行解剖果蝇幼虫的免疫组织化学。
Abstract
“
Protocol
在您开始之前
- 准备了以下解决方案：PBT（0.1％海卫X100在1X PBS），PBTB（0.2％BSA在PBT），和PBTN（在PBTB 2％的农工商超市）。
- 解剖果蝇幼虫。请参阅果蝇幼虫NMJ夹层。
免疫组织化学
- 移动到1.5 ml管中含有PBT的幼虫。幼虫洗净两次15分钟的PBT。注意：洗净，放在一个nutator混频器1.5 ml管。与pippetor取出的液体，并用新鲜的液体取代它。
- 卸下的PBT。 30分钟，在PBTB两次清洗。
- 取出的PBTB。在PBTN清洗两次15分钟。
- 孵育在稀释后在室温中PBTN 1小时或4 ° C过夜的主要抗体。
- 冲洗两次PBTB。注：冲洗添加解决方案，并迅速删除。
- PBTB 15分钟两次清洗。
- 在PBTN洗为30分钟。
- 孵育在二次抗体稀释在PBTN（和标记的抗体，如果你正在使用的一个）。
- 在锡纸孵育盖在室温下为1.5小时。
- 冲洗两次PBTB。
- PBTB 15分钟两次清洗。
- 继续安装。
安装
注：如果样本将被立即成像甘油山。如果样品将被保存一个多星期前成像，或者如果样品必须成像多次延长黄金山。若要使用，延长2-3分钟，在65℃水浴中放置一个瓶子。延长黄金等份，并保持在45-50 º C的热块
- 在PBT倒在一块手表玻璃染色PREPS。
- 一些甘油放在一个洁净的载玻片进行处理。
- 手表玻璃挑选出来一个角落使用镊子，将动物处理幻灯片。确保他们是角质层的一面朝下。
- 删除处理载玻片上的新鲜刀片的头部和尾部。这exacto刀与刀片＃16。
- 在另一张幻灯片（幻灯片安装），把一个小滴甘油/延长和蔓延，用干净的镊子。
- 将解剖的动物，其边缘安装的幻灯片，照顾，而不是反转。尝试安装在相同的方向行。山6-8动物每张幻灯片。
- 下降上盖玻片放入甘油EDGE /延长，慢慢地释放它。
- 指甲油密封的幻灯片。注[不要形象，直到清漆干燥。这通常需要10分钟。安装在延长黄金样品，让幻灯片的干燥密封或成像前至少三个小时。]
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Discussion
免疫组织化学（IHC）NMJ生物学研究是至关重要的，因为它使可视化的NMJ。这是通过使用的抗体，承认神经细胞膜（如辣根过氧化物酶），突触前（例如，CSP，SYT），和/或postsynapse（例如，DLG）。信号分子，结构蛋白，或利益的新的蛋白质，也可以染色。然后，基因突变或missexpressed，和IHC检测突触的结构和/或神经信号的扰动。
果蝇 NMJ年初以来，照亮它的基本结构和功能的研究已取得大受欢迎。1-4许多分子，在果蝇NMJ的研究中已确定的脊椎动物中保守的。4因此，通过研究了解到的见解果蝇NMJ可能适用于在许多系统中的突触生物学。一些可能的应用包括，在突触的发展，可塑性强，神经系统疾病的分子参与的研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
