Visuellt Medierad Lukt Tracking under Flygning i Drosophila

Summary

Här beskriver vi hur man kan optimera de förvärvade videon bilden för en olfactory magnetisk-tjuder (OMT) apparater. Vi beskriver också två prov försöksprotokoll för att studera visuo-lukt fusion.

Abstract

Flygande insekter använda visuella ledtrådar för att stabilisera sin rubrik i en vind ström. Många djur spårar dessutom lukt transporteras i vinden. Som sådan, visuell stabilisering av vindsidan spåra direkt stöd i lukt spårning. Men lukt-signaler direkt inflytande visuell spårning beteende oberoende av vind-signaler? Dessutom har de senaste framstegen inom lukt molekylär genetik och neurofysiologi motiverade nya kvantitativa beteendemässiga analyser för att bedöma beteendemässiga inflytande (t.ex.) genetiskt inaktivera specifika lukt aktivering kretsar. Vi ändrade en magnetisk tjuder system som ursprungligen utformades för vision experiment genom att utrusta arenan med smala lukt laminärt flöde plymer. Här fokuserar vi på experiment som kan göras efter en fluga är tjudrad och kan navigera i den magnetiska arenan. Vi visar hur man kan förvärva videobilder optimerad för att mäta kroppens vinkel, hur man bedömer stabil lukt spårning, och vi illustrerar två experiment för att undersöka påverkan av visuella referenser på lukt spårning.

Protocol

Den OMT är en anpassning av en magnetisk tjuder system ¹ syftar till att införa en virtuell ² plym simulator. Följande protokoll kommer att förklara hur man kan optimera de förvärvade videobilder (del 1) och köra två typer av grundläggande visuo-lukt experiment (del 2 & 3).

Del 1: Video Förvärv

Optimera videobilden är avgörande för kvaliteten på de förvärvade data. Följ dessa steg för renare bilder.

1. Placera en färsk tjudrad fluga på arenan med hjälp av en pincett.
2. Placera firewire styrelsen kameran (Fire-I 1394store.com) under klar akryl vakuumkammare så att kameran uppfattning är direkt uppåt genom kammaren, genom ett glasrör, till den ventrala delen av uppbundna flugan. Kontrollera att det inte finns någon IR-filter beläggning på linsen i videosystem.
3. Att belysa flyga, använd en rund samling av infraröda lysdioder (Små delar Inc) placeras precis under LED-paneler. Fokus varje lysdiod i farten kropp individuellt för jämn belysning.
4. För att minska bländning från panelen systemet och för att minimera visuella observeras av flugan, är det lämpligt att belägga alla reflekterande ytor inom kameravyn med platt svart färg. Rum belysning bör stängas av för att minska bländning och ljusstyrka moduleringar påvisbar med fluga öga.
5. Inspektera kamerabilden. Flugan bör vara ljust vitt mot svart bakgrund. Om bilden är suddig linsen kan behöva fokuseras. Om flugan är mörkt, kan lysdioder vara ofokuserad eller inte tillräckligt driven för att belysas ordentligt. Om bakgrunden innehåller ljusa föremål, montera en skiva av svart flock papper precis ovanför flugan för att minimera bakgrunden reflektans.
6. Vi förvärvar video med egna subrutiner skrivna i Matlab med hjälp av verktygslådan Image Acquisition.

Del 2: flyga hitta lukt plym

Ett enkelt experiment i OMT observerar en hungrig (svalt) flyger lokalisera och sedan aktivt spåra en plym av attraktiva mat lukt. Manipulera den visuella omgivningen påverkar flugans förmåga att kraftigt spåra en appetitive mat lukt. Observera att experimenten vanligtvis körs i en slumpmässig blocket format för att minimera eventuella bias i experimentell ordning. All extern hårdvara (gas multiplexorer, LED-arena, video förvärv) är kontrollerade av anpassade program rutiner skrivna i Matlab (Mathworks).

1. Placera en färsk tjudrad fluga på arenan med hjälp av en pincett.
2. Före varje experiment, med hjälp av visuella displayen rotera flyga flera varv ³ för att säkerställa en smidig rörelse runt hela 360 gir axel. Om flugan inte snurrar smidigt kassera den. Om problemet kvarstår, är den troliga orsaken dåligt magneter. Obs: Om fördelningen av arenan på väg till flera banor under spin rättegången visar signifikanta toppar (dvs är inte platt över 360 grader), finns det sannolikt en orientering fördomar på grund av dåligt magneter.
3. Presentera flyga med följande exempel experimentella förhållanden i slumpmässig ordning: i) hög kontrast randigt mönster med vattenånga som kommer från lukten hamnen, ii) hög kontrast randigt mönster med attraktiva lukt ångor, iii) en vertikal rand offset 90 grader från vattenånga munstycke, och iv) en enda 90 graders kompensera rand med lukt ånga. Vår erfarenhet är att 30 sekunders intervaller fungerar bra för experiment där flugorna utmanas att lokalisera lukten källan på egen hand. Vi förvärvar video med 30 Hz för länge varje experimentell skick och analysera offline bilderna med anpassad programvara rutiner skrivna i Matlab (ett av de mest användbara inbyggda i Matlab funktioner regionprops.m som analyserar den geometriska egenskaper hos en ellips.
4. När man använder höga lukt koncentrationer kan kvarvarande lukt avges från lukt hamnen efter lukten är avstängd. För att minimera eventuella effekter detta kan få är det bra att snurra flyga i några sekunder med en roterande panorama så att systemet för att spola ut eventuella kvarvarande lukt.
5. Det är också bra att visuellt rotera flyga mellan experimentella behandlingar för att (i) hålla flugorna aktivt engagerade i försöket och att (ii) hålla flugorna från att förbli på ett ställe. Ett exempel experiment kan ha följande ordning: i) tjugo andra initial diagnostik spin, ii) fem sekunder mellanliggande spin, iii) tjugo andra villkoret paret # 1, iv) fem sekunder mellanliggande centrifugering, v) tjugo andra villkoret paret # 2.

Del 3: flyga stannar kvar inom lukt plym

En andra grundläggande experiment i OMT är att visuellt dra en fluga till en lukt plym, omedelbart ändra visuella förhållanden och sedan mäta dess förmåga att stanna kvar i plymen. Återigen, notera att alla försök görs i en slumpmässig kvarter format för att minimera eventuella bias i experimentell ordning.

1. Placera en färsk tjudrad fluga på arenan med hjälp av en pincett.
2. Visuellt rotera (snurra) i farten flera varv runt arenan innan varje försök som ett diagnostiskt kontrollera att djuret har kapacitet att orientera i alla riktningar (se del 2.2).
3. Före varje tillstånd, slå på den experimentella lukt (vatten eller vinäger) och visuellt "dra" den flyga in i plymen av oscillerande en liten vertikal rand vid position plym. Detta tar nytta av de kraftfulla rand fixering beteende observerades hos flugor [4].
4. Nu när flugan är riktad mot plym, ta bort oscillerande rand och presentera följande exempel visuella villkor: i) hög kontrast panorama ränder med vattenånga (Fig. 1A), ii) en enhetlig bakgrund med vattenånga (Fig. 1B); iii) hög kontrast panorama ränder med lukt ånga (figur 1C), iv) enhetlig bakgrund med doft ånga (fig. 1D). Förvärva video som i 2,3. Ett exempel experiment kan ha det strömmande ordning: i) tjugo andra initial diagnostik spin, ii) fem sekunder plym rand svängning, iii) tjugo andra villkoret paret # 1, iv) fem sekunder plym rand svängning, v) tjugo andra villkoret paret # 2 .

Representativa resultat:

Figur 1

Del 1 förklarar hur man kan optimera OMT videobilder. Den videobild bör ha en tydlig bild av den belysta flyga på en mörk svart bakgrund. Alltför ljusa bilder kan förbättras genom att minska bakgrund störningar, minska intensiteten i IR-lysdioder, eller genom att stänga av rummet ljus. Om flugan är felaktigt belyst, kan justera fokus för IR-lysdioder eller modulera intensiteten av IR LEDs fixa problemet. Delarna 2 och 3 beskriver enkla experiment att genomföra för att verifiera en korrekt tillämpning av en OMT. I samtliga fall bör en fluga vara visuellt "tvingats" (via optomotor svar) att rotera flera varv på arenan för att säkerställa en smidig och komplett utbud av rörelse. I del 2 en fluga står inför utmaningen att finna en lukt plym på egen hand. För att hålla flugan engagerade i försöket att minska effekten av kvarvarande lukt release, och för att hålla flugorna från att behålla en enda rubrik under hela försöksperioden, är det lämpligt att visuellt rotera flyga ett par sekunder mellan studier. En fluga bör aldrig lokalisera en plym vattenånga i en betydande grad, och bör alltid lokalisera en lukt plym i närvaro av rika panorama visuella referenser. I del 3 en fluga är visuellt dras direkt in i en doft plym och utmanade att behålla sin rubrik inom plymen mot en rad olika stationära visuella bakgrund. Om flugan dras in i en vattenånga plym det skulle visa snabbt bort. Om flugan dras in i en lukt plym och det finns tillräckliga visuella ledtrådar att medla robust tracking, kommer flyga kvar i plymen.

Discussion

Bilden förvärv för detta system använder en billig kamera firewire styrelse och mjukvara skriven i Matlab. Tydliga bilder är avgörande för att få korrekta uppgifter spår. Strategierna som beskrivs ovan är användbara för att städa upp bilder i detta system. Övriga video spårning förfaranden för detta system har beskrivits ^1. Dessutom skulle detta system lätt ändras för att inkludera video i realtid spårning. Exemplet FÖRSÖKSPROTOKOLL beskrivs här avsedd att vara en utgångspunkt för att säkerställa korrekt drift av en OMT. Det är möjligt att experimentera med olika synliga och med olika dofter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Firewire camera	1394store.com	Fire-I board camera BW	4.3mm lens no IR coating
IR LEDs	Small Parts, Inc.
Black spray paint	Rustoleum		Flat black
Black flock paper	Edmund Scientific
Panel system	Caltech		3
Matlab 2006a	Mathworks		Image acquisition toolbox