Summary
Hier beschrijven we hoe u de verworven videobeeld te optimaliseren voor een geur magnetische-tether (OMT) toestellen. We beschrijven ook twee monsters experimentele protocollen voor het bestuderen van visueel-olfactorische fusie.
Abstract
Vliegende insecten gebruiken visuele signalen om hun kop in de wind stroom te stabiliseren. Veel dieren extra spoor geuren uitgevoerd in de wind. Als zodanig, visuele stabilisatie van de wind tracking direct helpt bij het volgen van geur. Maar maak je olfactorische signalen direct invloed op visuele tracking gedrag onafhankelijk van wind signalen? Bovendien hebben de recente ontwikkelingen in de olfactorische moleculaire genetica en de neurofysiologie gemotiveerde nieuwe kwantitatieve gedrag analyses om de invloed van gedrag (bijvoorbeeld) genetisch inactiveren van specifieke geur activering circuits te beoordelen. We pasten een magnetisch koord systeem oorspronkelijk ontworpen voor het gezichtsvermogen experimenten door de inrichting van de arena met een smalle laminaire stroming geur pluimen. Hier richten we ons op experimenten die kunnen worden uitgevoerd na een vlieg is aangebonden en is in staat om te navigeren in de magnetische arena. We laten zien hoe u videobeelden geoptimaliseerd voor het meten van het lichaam hoek, hoe stabiel geur tracking rechter te verwerven, en we illustreren twee experimenten om de invloed van visuele signalen op geur tracking onderzoeken.
Protocol
Het OMT is een aanpassing van een magnetische ketting systeem 1 is ontworpen om een virtuele pluim simulator 2 te nemen. De volgende protocollen wordt uitgelegd hoe je de verkregen videobeelden (deel 1) te optimaliseren en uit te voeren twee types van de fundamentele visueel-olfactorische experimenten (deel 2 & 3).
Deel 1: Video Acquisition
Het optimaliseren van het videobeeld is cruciaal voor de kwaliteit van de verkregen gegevens. Volg deze stappen voor schonere beelden.
- Plaats een vers vastgebonden vlieg in de arena met behulp van een pincet.
- Plaats de firewire board camera (Fire-I 1394store.com) onder de heldere acryl vacuümkamer, zodat de camera te bekijken is direct naar boven door de kamer, door middel van een glazen buis, aan de ventrale aspect van de vastgebonden vliegen. Zorg ervoor dat er geen IR filter coating op de lens van de video-systeem.
- Om verlichten de vlieg, gebruik dan een ronde array van infrarood LED's (kleine onderdelen Inc) geplaatst net onder de LED-panelen. Focus elke LED op het lichaam van de vlieg individueel voor een gelijkmatige verlichting.
- Om verblinding te verminderen van het paneel systeem en visuele signalen waargenomen door de vlieg een minimum te beperken, is het handig om vacht alle reflecterende oppervlakken in de camera te bekijken met platte zwarte verf. Ruimte verlichting moet worden uitgeschakeld om schittering en helderheid modulaties detecteerbaar door het oog van de vlieg te verminderen.
- Inspecteer het camerabeeld. De vlieg moet helder wit tegen een zwarte achtergrond te worden. Als het beeld wazig is de lens moet mogelijk worden geconcentreerd. Als de vlieg donker is, kan de LED-array ongeconcentreerd of onvoldoende voeding voor een goede verlichting. Als de achtergrond bevat heldere objecten, monteren een schijf van zwarte schapen papier net boven de vliegen naar de achtergrond reflectie te minimaliseren.
- We verwerven video met aangepaste subroutines geschreven in Matlab met behulp van de Image Acquisition Toolbox.
Deel 2: De vlieg het vinden van de geur pluim
Een eenvoudig experiment in het OMT is het observeren van een hongerige (uitgehongerd) vliegen lokaliseren en vervolgens het actief volgen een pluim van aantrekkelijke voedsel geur. Het manipuleren van de visuele omgeving van invloed op de vlieg in staat is om robuuste volgen een begeerteaard voedsel geur. Merk op dat typisch experimenten worden uitgevoerd in een willekeurige blok formaat naar een eventuele afwijking in de experimentele te minimaliseren. Alle externe hardware (gas multiplexers, LED arena, video acquisitie) worden aangestuurd door aangepaste software routines geschreven in Matlab (Mathworks).
- Plaats een vers vastgebonden vlieg in de arena met behulp van een pincet.
- Voor elke experiment, met behulp van de visuele weergave, draai-the-fly voor meerdere revoluties 3 tot en met een soepele beweging rond de gehele 360 yaw-as te verzekeren. Als de vlieg draait niet soepel gooi hem weg. Als het probleem zich blijft voordoen, de waarschijnlijke oorzaak is uitgelijnd magneten. Opmerking: Als de verdeling van de arena op weg naar een aantal trajecten in de spin-studie toont significante pieken (dus niet vlak meer dan 360 graden), is er waarschijnlijk een oriëntatie vertekening als gevolg van niet goed uitgelijnd magneten.
- Presenteer de vliegen met de volgende voorbeeld experimentele condities in willekeurige volgorde: i) een hoog contrast gestreept patroon met waterdamp afkomstig van de geur-poort; ii) een hoog contrast gestreept patroon met een aantrekkelijke geur damp, iii) een enkele verticale streep offset 90 graden uit de waterdamp mondstuk, en iv) een enkele 90 graden offset streep met geur damp. In onze ervaring, 30 seconden werken goed voor experimenten waar vliegen worden uitgedaagd om de geurbron lokaliseren op hun eigen. We verwerven video bij 30 Hz voor de duur van elke experimentele conditie en analyseren van de beelden offline gebruik van aangepaste software routines geschreven in Matlab (een van de meest nuttige ingebouwde Matlab functies is regionprops.m die de geometrische eigenschappen van een ellips analyses.
- Bij het gebruik van hoge concentraties geur, kunnen resterende geur worden vrijgesteld van de geur poort na de geur is uitgeschakeld. Het minimaliseren van de eventuele gevolgen dit kan hebben is het nuttig om de vliegen spin voor een paar seconden met een roterende panorama om het systeem uit te spoelen eventueel resterende geur.
- Het is ook gunstig voor de vliegen tussen de experimentele behandelingen visueel draaien om (i) houdt de vliegen actief betrokken bij het experiment en (ii) vliegen te houden van de nog in een plek. Een voorbeeld experiment kunnen de volgende volgorde: i) twintig seconden de eerste diagnostische draaien, ii) vijf seconden tussentijds centrifugeren, iii) twintig tweede voorwaarde paar # 1; iv) vijf seconden tussentijds centrifugeren; v) twintig seconden voorwaarde paar # 2.
Deel 3: De vlieg blijft binnen de geur pluim
Een tweede fundamentele experiment in het OMT is om visueel te slepen een vlieg in een geur pluim, ogenblikkelijk veranderen de visuele omstandigheden, en meet vervolgens de mogelijkheid om te blijven in de pluim. Nogmaals, rekening mee dat alle experimenten worden uitgevoerd in een willekeurig blok format tot een vertekening in experimentele te minimaliseren.
- Plaats een vers vastgebonden vlieg in de arena met behulp van een pincet.
- Visueel draaien (spin) van de vliegen een paar keer rond de arena voor elke experiment als een diagnostische controle om ervoor te zorgen dat het dier het vermogen te oriënteren in alle richtingen is (zie deel 2.2).
- Voor elke conditie, zet de experimentele geur (water of azijn) en visueel "slepen" het vliegen in de pluim door oscillerende een kleine verticale streep op de positie van de pluim. Deze maakt gebruik van de krachtige streep fixatie gedrag waargenomen in vliegt [4].
- Nu het vliegen is gericht op de pluim, verwijder de oscillerende streep en de volgende monster visuele omstandigheden: i) een hoog contrast panoramisch strepen met waterdamp (Fig. 1A), ii) een uniforme achtergrond met waterdamp (Fig. 1B); iii) hoog contrast panoramisch strepen met geur damp (Fig. 1C), iv), egale achtergrond met geur damp (fig. 1D). Verwerven van video als in 2.3. Een voorbeeld experiment kan de vloeiende volgorde: i) twintig seconden de eerste diagnostische draaien, ii) vijf seconden pluim streep oscillatie, iii) twintig tweede voorwaarde paar # 1; iv) vijf seconden pluim streep oscillatie; v) twintig seconden voorwaarde paar # 2 .
Representatieve resultaten:
Figuur 1
Deel 1 legt uit hoe het optimaliseren van de OMT videobeelden. Het videobeeld moet een duidelijk zicht op de verlichte vliegen op een donkere zwarte achtergrond. Overdreven heldere beelden kunnen worden verbeterd door het verminderen van storing op de achtergrond, waardoor de intensiteit van de IR-LED's, of door het uitschakelen van verlichting in de kamer. Als de vlieg niet goed verlicht, kan het aanpassen van de focus van de IR LED's of het moduleren van de intensiteit van de IR LED's het probleem te verhelpen. Deel 2 & 3 te beschrijven eenvoudige experimenten uit te voeren om de goede werking van een OMT verifiëren. In alle gevallen moet een vlieg visueel worden "gedwongen" (via optomotor reacties) om meerdere revoluties in de arena draaien om een vlotte en volledige bereik van de beweging te verzekeren. In deel twee een vlieg wordt uitgedaagd om een geur pluim te vinden op zijn eigen. Om de vliegen die zich bezighouden met het experiment te houden, om het effect van de resterende geur vrij te verminderen en om vliegen te houden van het handhaven van een enkele post gedurende het experiment, is het nuttig om visueel draai de vliegen voor een paar seconden tussen de proeven. Een vlieg mag nooit localiseren een pluim waterdamp in belangrijke mate, en dient altijd te lokaliseren een geur pluim in de aanwezigheid van rijke panoramisch visuele cues. In deel 3 van een vlieg is visueel direct meegesleurd in een geur pluim en uitgedaagd om zijn kop in de pluim tegen een verscheidenheid van stationaire visuele achtergrond te houden. Als de vlieg wordt meegesleurd in een waterdamp pluim, moet snel weg te draaien. Als de vlieg wordt meegesleurd in een geur pluim en er voldoende visuele aanwijzingen om robuuste tracking bemiddelen, zal de vlieg blijven in de pluim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het beeld aanwinst voor dit systeem maakt gebruik van een goedkoop firewire board camera en software geschreven in Matlab. Heldere beelden zijn cruciaal voor het verkrijgen van accurate gegevens sporen. De strategieën hierboven beschreven zijn nuttig voor het opruimen van afbeeldingen in dit systeem. Andere video-tracking procedures voor dit systeem zijn beschreven 1. Bovendien kan dit systeem eenvoudig worden aangepast om real-time video-tracking te nemen. Het voorbeeld experimentele protocollen beschreven hier bedoeld als een uitgangspunt om de goede werking van een OMT te garanderen. Het is mogelijk om te experimenteren met verschillende visuele displays en zelfs verschillende geuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gefinancierd door een subsidie van de National Science Foundation om MF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Firewire camera | 1394store.com | Fire-I board camera BW | 4.3mm lens no IR coating |
| IR LEDs | Small Parts, Inc. | ||
| Black spray paint | Rustoleum | Flat black | |
| Black flock paper | Edmund Scientific | ||
| Panel system | Caltech | 3 | |
| Matlab 2006a | Mathworks | Image acquisition toolbox |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).
- Götz, K. G. Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).
