Summary
في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.
Abstract
وكانت أول أجنة البويضات cryopreserved بنجاح أكثر من 30 عاما مضت ، عندما يتنغهام
Protocol
أجريت رعاية الحيوان والإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في بحوث الحيوان والإنسان في جامعة برشلونة المستقلة ، إسبانيا.
أولا جمع سيت
- وحدد الاختيار الهامستر الإناث (Mesocricetus auratus ؛ 12/08 الاسبوع القديمة) من سلالة السوري الذهبي عن وجود إفرازات مهبلية سميكة (التفريغ بعد الإباضي).
- حمل الإناث المحدد إلى superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 40 وحدة دولية من PMSG (ماري الحامل مصل موجهة الغدد التناسلية) ، يليه 40 وحدة دولية من (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية) قوات حرس السواحل الهايتية 60 ساعة في وقت لاحق.
- هامستر أنثى الموت ببطء بعد 16 ساعة من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية في غرفة الكربون ثاني أكسيد الكربون.
- عزل ناقلة البيضات من الإناث كما هو مبين في الفيديو ونقلها إلى قطرة من KSOM - H المتوسط.
- جمع البويضة ، قزع المجمعات التي تمزق أمبولة قناة البيض تحت المجهر مجسمة في قطرة من هيالورونيداز (156 U / مل) على 37 درجة مئوية. وسيتم اطلاق سراح من خلايا البويضات الركامية في حوالي 5 دقائق.
- التقاط البويضات من هيالورونيداز وغسلها مرتين في KSOM - H المتوسط.
لجمع أجنة الفئران والفئران الإناث (المصحف العضلة ؛ 6-8 الاسبوع القديمة) وحثهم على superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية من PMSG تليها 5 وحدة دولية من 48 ساعة في وقت لاحق قوات حرس السواحل الهايتية وتزاوج مع الفئران الذكور. وضحى الاناث ، من خلال عنق الرحم في خلع 24-26 ، 44-46 أو 54-56 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية لobtention pronuclear التوالي من 2 خلايا الأجنة أو مرحلة 4 خلايا ، ،. يتم تنفيذ مجموعة من الأجنة pronuclear تماما كما وصفها لالبويضات الهامستر. يتم جمع الأجنة في المراحل 2 - الخلية والخلية 4 * شطف ناقلة البيضات مع KSOM - H المتوسطة [6].
ملاحظة : بعد هذا البروتوكول يمكن جمع حوالي 20 إلى 30 البويضات / الأجنة الإناث من كل.
II. إعداد تجميد والذوبان حلول
- يعد حل لي تمييع 0.57 مل من propilenglycol في 5 مل من KSOM - H (1.5 م من propilenglycol).
- يعد حل ذوبان بإضافة 2 مل من KSOM - H إلى أنبوب مع السكروز ز 0.2052 (0.3 م من السكروز).
- يعد حل تجميد بإضافة 2 مل من محلول الأول لأنبوب مع السكروز ز 0.0684 (1.5 م و 0.1 من propilenglycol السكروز M).
ملاحظة : يجب أن أكون مستعدا الحل والتجميد والذوبان حلول عادلة قبل استخدامها. ومع ذلك ، قد تكون مرجحة لكميات محددة من السكروز لاستخدامها في التحضير للتجميد والذوبان في حلول مسبقة وتخزينها في أنابيب ML - 3 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
III. تجميد البروتوكول
- نقل البويضات / الأجنة من المتوسط KSOM - H إلى انخفاض الحل الأول واحتضان ل15/07 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وفي الوقت نفسه ، بإعداد طبق بتري 90 ملم لتحميل القش عن طريق وضع قطرات 90 ميكرولتر من التجمد والذوبان الحلول كما هو مبين في الفيديو (1 قطرة من كل حل / القش).
- نقل العدد المرغوب فيه من البويضات / الأجنة إلى حل تجميد قطرات.
ملاحظة : نقوم بنقل عادة ما بين 5-30 البويضات أو الأجنة / قطرة. - إرفاق القش لتطلع نظام للرقابة والفم تحميله التالية بهذا الترتيب : الحل الأول ، والهواء ، وانخفاض تجميد البويضات مع والهواء وانخفاض ذوبان الجليد ، والهواء.
- بمجرد أن يتم تحميل القش ، والحفاظ على الشفط حتى أول انخفاض قدم (الحل الأول) تصل إلى البوليمر في نهاية العلوي من القش والأختام هذه الغاية. الحرارية ختم الطرف الآخر من القش أو الختم مع المكونات البلاستيكية.
- التبديل في الثلاجة للبرمجة وحدد البرنامج التجمد. ويستند البرنامج تجميد المستخدمة في هذا البروتوكول على معدلات التبريد نشرت أصلا لاسال وآخرون. [7] :
- 2 درجة مئوية / دقيقة من درجة حرارة الغرفة ل-7 درجة مئوية
0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 10 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة وتحريض بذر (أنظر أدناه) - 0.3 درجة مئوية / دقيقة من -7 -30 درجة مئوية إلى درجة مئوية
0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 2 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة - 35 درجة مئوية / دقيقة من -30 درجة مئوية إلى -130 درجة مئوية
- 2 درجة مئوية / دقيقة من درجة حرارة الغرفة ل-7 درجة مئوية
- تحميل القش على فتحات لصاحب الثلاجة للبرمجة ، والتأكد من أن جزءا من القش مع ذوبان قطرة من حل تواجه الخارج. بدء برنامج التجميد.
- عندما تصل درجة حرارة العينة -7 درجة مئوية وتبريد قيد الانتظار ، نفذ دليل البذر : ملقط يغرق في النيتروجين السائل ، وسحب أصحاب قليلا من خارج الثلاجة لكشف جزء من القش التي تحتوي على قطرات من ذوبان الحل ، وعلى الفور لمس هذا الجزء من القش مع ملقط. كرر لكل حامل والقش في كل حامل ، واسمحوا ثم تجميد برنامج تشغيل حتى النهاية.
- عندما يتم الانتهاء من البرنامج ، يغرق في حملة النيتروجين السائل.
- إزالة من القشأصحاب ونقلها إلى gobelet المسمى.
- أخيرا ، تخزين gobelet داخل خزان النتروجين السائل.
رابعا. ذوبان بروتوكول
- إزالة القش من خزان النتروجين السائل.
- الحفاظ على القش في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 ثانية.
- نقع القش في حمام الماء عند 30 درجة مئوية خلال 40 ثانية.
- إزالة المكونات من قش أو خفض رأس الحرارية مختوم.
- إفراغ القش في طبق بتري 35 ملم والمزيج برفق قطرات يحتويان على تجميد والذوبان الحلول.
- ترك البويضات / الأجنة في الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل البويضات / الأجنة إلى هبوط جديد للKSOM - H لمدة 15 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية.
- البويضات / الأجنة على استعداد الآن للتلاعب أخرى.
ملاحظة : أثناء الخطوتين 6 و 7 سترى أن إذابة البويضات / الأجنة تنتفخ ببطء بسبب الجفاف.
خامسا نتائج الممثل
وذكرت واستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد هنا النتائج في معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 95 ٪ للبويضات وحيوانات أليفة 90 ٪> ، 85 ٪ و 80 ٪ للأجنة B6CBAF1 الماوس في pronuclear ، 2 خلية خلية مراحل و 4 على التوالي. عندما يتم تربيتها في المختبر أجنة فئران في KSOM بعد ذوبان الجليد ، وينبغي أن لا يقل عن 70 إلى 80 ٪ تصل إلى مرحلة الكيسة الثقافة في ظروف مثلى.
فمن المستحسن أن تقوم بتضمين مجموعة التحكم (القش) من البويضات / الأجنة في كل تجربة تجميد والذي أذاب هذه المجموعة قبل أن يتم استخدام ما تبقى من البويضات / الأجنة لمزيد من التلاعب. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لمجموعة المراقبة هي أقل مما كان متوقعا ، أذاب آخر القش من الكثير واحد. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لهذه المجموعة الثانية هي أيضا منخفضة ، وتجاهل القش المتبقي من هذا الكثير التجمد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يكون هذا مع البويضات والأجنة الهامستر بروتوكول الماوس cryopreserved بنجاح. المجمدة مرة واحدة ، يمكن تخزين البويضات / الأجنة في النيتروجين السائل الدبابات إلى أجل غير مسمى وتسترد في أي زمان أو مكان المطلوب. هذا يوفر ميزة وجود عينات جاهزة تقريبا لاستخدام كلما دعت الحاجة. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لتوليد cryobanks الجنين من سلالات قيمة الماوس (مثل خطوط المعدلة وراثيا) ، كبديل أكثر أمنا واقتصادا في الحفاظ على مستعمرات الحيوانات الحية. ومن المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول هو الأمثل لcryopreserve البويضات الهامستر والهجين B6CBAF1 أجنة الفئران. وقد وصفت الفروق في معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد بين أجنة الفأر مع خلفيات وراثية مختلفة 8،9 ، وبالتالي يجب الحرص على تقييم ظروف الحفظ بالتبريد على كل الأنواع أو سلالة من البويضات / الأجنة ووضع البروتوكول المناسب قبل جيل من البويضة cryobanks أو الجنين.
ويمكن استخدام البويضات البشرية الهامستر في عيادات المساعدة على الإنجاب لاختبار اختراق الحيوانات المنوية أو لتحليل الحيوانات المنوية كروموسوم 10 ، أو ممارسة المادية للمبتدئين في حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى (الحقن المجهري). من ناحية أخرى ، يمكن استخدام الماوس الهجين B6CBAF1 الأجنة في المراحل pronuclear أو 2 في الخلية البشرية مراكز المساعدة على الإنجاب أو في مختبرات الأبحاث للتحقق من نوعية وسائل الإعلام أو الثقافة الجنين حسن سير العمل في الحاضنات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل MINISTERIO Ciencia الاسبانية دي ذ Educación (BIO 2006-11792) وكتالونيا دي كاتالونيا (2005 SGR00437). وأود أن أشكر كتاب مارك لوكاس Jonatan Puigcerver ولما قدموه من مساعدة فنية في إعداد وسائل الإعلام. ومن المسلم به جميع الموظفين من Estabulari ديفوار Servei للإسكان الحيوانات ، وخصوصا خوان خوسيه مارتن وخافيير بنيتو لمساهمتهم إضافية حول تسجيل جزء من هذا الفيديو. البنك الأهلي التجاري هو زميل في الفقرة قرينتها البرتغالية ه Ciência بحوث والتكنولوجيا وسان جرمان هو زميل إسباني MINISTERIO دي Educación Ciencia ذ.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
