Summary
在这个视频文章中，我们提出了一个一步一步示范如何收集和仓鼠卵母细胞冻存与解冻后的存活率。同样的程序也可以应用，成功地冻结和解冻在不同阶段的小鼠胚胎着床前的发展。
Abstract
首次成功地冻存胚胎和卵母细胞超过30年前，当惠廷厄姆
Protocol
根据Universitat，西班牙巴塞罗那自治大学的动物和人类研究伦理委员会批准的准则和法规，动物保健和程序进行。
一，卵母细胞收集
- 检查，并选择女仓鼠（Mesocricetus鲫; 8-12周的老）金厚厚的阴道放电（postovulatory放电）的存在叙利亚应变。
- 诱导选定的女性，60小时后腹腔注射40 IU PMSG（孕马血清促性腺激素）40国际单位的HCG（绒毛膜促性腺激素）其次superovulate。
- 安乐死女仓鼠，16小时后，HCG在二氧化碳室管理。
- 隔离在视频所示的女性输卵管，并将它们传送到KSOM - H培养基下降。
- 撕裂立体显微镜下输卵管壶腹部，透明质酸酶（156 U /毫升）下降收集卵母细胞卵丘复合物，在37 ° C。将被释放卵母细胞的卵丘细胞在大约5分钟。
- 拿起从透明质酸酶的卵母细胞和KSOM - H培养基洗两次。
对于收集的小鼠胚胎，雌性小鼠（家鼠; 6-8周的老）诱导，superovulate通过腹腔注射5 IU PMSG其次是5 IU hCG的48小时内，并与雄性小鼠交配。女性在24-26颈椎脱位处死，44-46或54-56小时后，HCG为原核，2芯或4细胞阶段的胚胎，分别obtention管理。仓鼠卵母细胞原核胚胎的收集是完全执行。在2 - 细胞和4细胞阶段的胚胎收集输卵管冲洗KSOM - H培养基[6]。
注：本议定书约20至30的卵母细胞/的胚胎可以从每个女性收集 。
二。制备冷冻和解冻的解决方案
- 准备的解决方案，我在KSOM - H（1.5米的propilenglycol）5毫升稀释0.57毫升propilenglycol。
- 准备加入2毫升的KSOM - H与0.2052 g蔗糖（蔗糖的0.3 M）的管解冻的解决方案。
- 准备加入0.0684 g蔗糖（1.5米propilenglycol和0.1 M的蔗糖）2毫升的解决方案，我管冻结的解决方案。
注：我的解决方案和冷冻和解冻的解决方案必须就其使用前的准备 。 然而，蔗糖指定要编制的冷冻和解冻的解决方案中使用的金额可能会提前加权和3毫升管在室温下保存数月。
三。冻结协议
- 转让卵母细胞/胚胎KSOM - H培养基的解决方案，我下降为7-15分钟，在室温下孵育。
- 同时，准备了90毫米的培养皿中加载的吸管放置90μL滴冻结和解冻的解决方案，因为它是在视频（1滴每个解决方案/稻草）所示。
- 转移所需的卵母细胞/胚胎数的冻结溶液滴。
注：我们通常5至30个卵母细胞或胚胎/下降之间的转移。 - 将一根救命稻草，一个口控制的愿望系统，下面这个命令：解决方案，我的卵母细胞，空气，解冻下降，空气冻结下降，空气，加载它。
- 一旦秸秆被加载，保持吸气，直到第一个下拉介绍（解决方案），达到了高端的秸秆和密封为此聚合物。热密封的稻草或用塑料塞密封的另一端。
- 可编程的冷冻开关并选择冻结计划。冻结在本议定书中所使用的程序是基于最初由拉萨尔等发表的冷却速率。 [7]：
- 2 ° C /分钟从室温到-7 ° C
0 ° C /分钟为10分钟，让温度平衡和诱导播种（见下文） - 0.3 ° C /分钟，从-7 ° C至-30 ° C
0℃/分钟2分钟，让温度平衡 - 35 ° C /分钟从-30 ° C到-130 ° C
- 2 ° C /分钟从室温到-7 ° C
- 可编程冷冻人的插槽装入秸秆，确保秸秆解冻液下降部分是朝外。启动冻结的方案。
- 当样品的温度达到-7℃，并保持冷却，进行人工播种：陷入液氮钳，稍微拉冰柜的持有人揭露的部分包含滴解冻液吸管，并立即触摸这部分镊子的吸管。重复每个持有人，持有人在每个稻草，然后让程序运行，直到最后的冻结。
- 当程序完成后，投身于液氮中的持有人。
- 取出的吸管持有人及他们转移到一个标记gobelet。
- 最后，商店内的液氮罐gobelet。
四。解冻协议
- 从液氮罐中取出一根稻草。
- 保持秸秆在常温下为40秒。
- 浸泡在30℃水浴中的稻草，在40秒。
- 从秸秆中取出插头或切断热密封提示。
- 空秸秆在35毫米培养皿，轻轻地混合两滴含冷冻和解冻的解决方案。
- 混合物在室温下15分钟留在卵母细胞/胚胎。
- 一个额外的15分钟内的卵母细胞/胚胎转移到一个新鲜的KSOM - H下降，在37 ° C。
- 卵母细胞/胚胎，现在准备进一步的处理。
注意：在步骤6和7，你应该看到，解冻卵母细胞/胚胎慢慢地膨胀起来由于补液。
五，代表性的成果
使用的冷冻保存协议仓鼠卵母细胞中大约95％和> 90％，85％和80％的鼠标B6CBAF1胚胎的原核细胞和4 - 细胞阶段，分别的成活率在这里报告的结果。当KSOM在体外培养小鼠胚胎解冻后，至少有70％至80％应达到最佳的培养条件胚泡阶段。
建议你包括在每个冻结的实验和对照组（秸秆）的卵母细胞/胚胎解冻本组之前，其余的卵母细胞/胚胎用于进一步操作。如果对照组的生存率低于预期，解冻同一地段的另一稻草。如果这个第二组的存活率也低，放弃从这个冻结大量剩余的秸秆。
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Discussion
与本议定书仓鼠卵母细胞和小鼠胚胎，可以成功地冷冻保存。一旦冷冻，卵母细胞/胚胎可以无限期地储存在液氮罐，并期望在任何时间或地点恢复。这提供了样品几乎准备在需要使用时的优势。另一方面，这个协议也可以用于生成有价值的小鼠品系（如转基因株系），作为经济和更安全的替代维护活体动物殖民地，胚胎cryobanks。重要的是要注意，这个协议是优化冻存仓鼠卵母细胞和混合B6CBAF1小鼠胚胎。之间的差异与不同遗传背景的小鼠胚胎解冻后的存活率已8,9，因此应小心评估每一个物种或应变的卵母细胞/胚胎冷冻保存条件，并建立相应的协议前的卵母细胞的产生或胚胎cryobanks。
仓鼠卵母细胞，可用于人类辅助生殖诊所，精子穿透试验或精子染色体核型分析10，或对卵胞浆内单精子注射（ICSI）的初学者练习材料。另一方面，鼠标，在原核或2细胞阶段的胚胎混合B6CBAF1可以用在人类辅助生殖中心，或在实验室检查的胚胎培养基或孵化器的正常运作的质量。
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Acknowledgments
这项工作是支持西班牙Ministerio教育Ÿ Ciencia（生物2006-11792）和Generalitat加泰罗尼亚（2005 - SGR00437）。作者想感谢他们的技术援助马克Puigcerver和Jonatan卢卡斯在准备媒体。 Servei D' Estabulari的所有工作人员承认动物的住房，尤其是胡安何马丁和贝尼托哈维尔为他们录制这个视频的一部分的额外贡献。 NCB是葡萄牙Fundação第一个Ciência发送Tecnologia和SG是西班牙Ministerio教育Ÿ Ciencia研究员研究员。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
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- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
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- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
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- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
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