Summary
In deze video-artikel stellen we een stap-voor-stap demonstratie over hoe het verzamelen en hamster eicellen cryopreserve met een hoge post-dooi overleving. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast om met succes vorst en dooi muis embryo's in verschillende stadia van pre-implantatie ontwikkeling.
Abstract
Embryo's en eicellen werden voor het eerst met succes meer dan 30 jaar geleden ingevroren, toen Whittingham
Protocol
Verzorging van dieren en de procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en verordeningen zijn goedgekeurd door de ethische commissie op Animal and Human Onderzoek van de Universitat Autònoma van Barcelona, Spanje.
I. Oocyte collectie
- Controleer en selecteer vrouwelijke hamsters (Mesocricetus auratus, 8-12 week oud) van de Gouden Syrische stam voor de aanwezigheid van een dikke vaginale afscheiding (postovulatory ontlading).
- Induceren geselecteerde vrouwen om superovulate door intraperitoneale injectie van 40 IE PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrofine), gevolgd door 40 IE hCG (humaan choriongonadotrofine) 60 uur later.
- Euthanaseren vrouwelijke hamsters 16 uur na toediening van hCG in een kooldioxide kamer.
- Isoleer eileiders van de vrouwtjes, zoals aangegeven in de video en overbrengen naar een daling van KSOM-H medium.
- Verzamel eicel-cumulus complexen door het scheuren van de eileider ampulla onder een stereoscopische microscoop in een druppel hyaluronidase (156 U / ml) bij 37 ° C. Eicellen zullen bevrijd worden van cumulus cellen in ongeveer 5 minuten.
- Pick-up eicellen van hyaluronidase en twee keer was ze in KSOM-H medium.
Voor het verzamelen van muizenembryo's, vrouwelijke muizen (Mus musculus, 6-8 weken oud is) worden aangezet tot superovulate door intraperitoneale injectie van 5 IE PMSG gevolgd door 5 IE hCG 48 uur later en gekoppeld met mannelijke muizen. Vrouwtjes zijn opgeofferd door cervicale dislocatie op 24-26, 44-46 of 54-56 uur na de toediening van hCG voor de verkrijging van pronuclear, 2-cel of 4-cellig stadium embryo's, respectievelijk. Het verzamelen van pronuclear embryo's is precies uitgevoerd zoals beschreven voor de hamster eicellen. Embryo's op de 2-cel en 4-cel fasen worden verzameld door het spoelen van de eileiders met KSOM-H medium [6].
NB: Naar aanleiding van dit protocol ongeveer 20 tot 30 eicellen / embryo's kunnen worden verzameld van elke vrouw.
II. Voorbereiding van invriezen en ontdooien oplossingen
- Bereid oplossing die ik door het verdunnen van 0,57 ml van propilenglycol in 5 ml KSOM-H (1,5 M van propilenglycol).
- Bereid ontdooien oplossing door toevoeging van 2 ml van KSOM-H in een buis met 0,2052 g sucrose (0,3 M sucrose).
- Bereid bevriezen oplossing door toevoeging van 2 ml van oplossing I, een buis met 0,0684 g sucrose (1,5 M van propilenglycol en 0,1 M sucrose).
Let op: Oplossing I en invriezen en ontdooien oplossingen moeten worden voorbereid vlak voor het gebruik ervan. Echter, mogen de gespecificeerde hoeveelheden sucrose te worden gebruikt voor de bereiding van het invriezen en ontdooien oplossingen worden gewogen op voorhand en opgeslagen in een 3 ml-buizen bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden.
III. Invriezen protocol
- Transfer eicellen / embryo's uit de KSOM-H medium tot een daling van de oplossing I en incubeer gedurende 7-15 minuten bij kamertemperatuur.
- Ondertussen bereiden een 90 mm petrischaaltje de rietjes lading door het plaatsen van 90 pl druppels van invriezen en ontdooien oplossingen zoals het is weergegeven in de video (een druppel van elke oplossing / stro).
- Breng de gewenste aantal eicellen / embryo's op de bevriezing oplossing daalt.
Opmerking: Wij dragen doorgaans tussen de 5 tot 30 eicellen of embryo's / drop. - Bevestig een rietje om een mond gecontroleerd afzuigsysteem en laad het in deze volgorde: oplossing I, lucht, bevriezing druppel met de eicellen, lucht, ontdooien drop, lucht.
- Zodra het stro is geladen, houd opzuigen tot de eerste druppel geïntroduceerd (oplossing I) bereikt het polymeer aan de bovenkant van het rietje en afdichtingen dit doel. Thermo-seal het andere uiteinde van het rietje of zegel met een plastic plug.
- Schakelaar op de programmeerbare vriezer en selecteer de bevriezing programma. De bevriezing programma dat gebruikt wordt in dit protocol is gebaseerd op de koelsnelheden oorspronkelijk gepubliceerd door Lassalle et al.. [7]:
- 2 ° C / min van kamertemperatuur tot -7 ° C
0 ° C / min gedurende 10 min om te zorgen voor de temperatuur evenwicht en inductie van zaaien (zie hieronder) - 0,3 ° C / min van -7 ° C tot -30 ° C
0 ° C / min gedurende 2 minuten, zodat de temperatuur evenwicht - 35 ° C / min van -30 ° C tot -130 ° C
- 2 ° C / min van kamertemperatuur tot -7 ° C
- Laad de rietjes op de slots van de houder van de programmeerbare vriezer, om ervoor te zorgen dat het deel van het stro met de daling van het ontdooien oplossing is naar buiten gericht. Start het programma bevriezen.
- Bij het monster temperatuur -7 ° C en de koeling in de wacht heeft bereikt, handmatige zaaien: duik de tang in vloeibare stikstof, trek de houders iets uit de vriezer om het deel van de rietjes met de druppels van de oplossing ontdooien bloot te leggen, en onmiddellijk druk dit deel van de rietjes met de tang. Herhaal dit voor iedere houder en iedere stro in de houder, en laat het bevriezen programma loopt tot eind.
- Wanneer het programma voltooid is, duiken de houders in vloeibare stikstof.
- Haal de rietjes uit dehouders en overbrengen naar een gelabelde gobelet.
- Tot slot, slaan de gobelet in een vloeibare stikstof tank.
IV. Ontdooien protocol
- Verwijder het rietje uit de vloeibare stikstof tank.
- Handhaaf het stro bij kamertemperatuur gedurende 40 seconden.
- Geniet van het stro in een waterbad op 30 ° C gedurende 40 seconden.
- Haal de stekker uit het stro of knip de thermo-verzegelde tip.
- Lege het stro in een 35-mm petrischaal en meng de twee druppels met het invriezen en ontdooien oplossingen.
- Laat eicellen / embryo's in het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Transfer oöcyten / embryo 'om een nieuwe daling van KSOM-H voor een extra 15 minuten bij 37 ° C.
- Oöcyten / embryo 's zijn nu klaar voor verdere manipulatie.
Opmerking: Tijdens de stappen 6 en 7 moet je zien dat de ontdooide eicellen / embryo langzaam opzwellen als gevolg van rehydratatie.
V. representatieve resultaten
Het gebruik van de cryopreservatie protocol hier gerapporteerde resultaten in een overleving van ongeveer 95% voor de hamster en de eicellen van> 90%, 85% en 80% voor de muis B6CBAF1 embryo's in het pronuclear, twee-cel en 4-cel podia, respectievelijk. Wanneer de muis embryo's worden gekweekt in vitro in KSOM na het ontdooien, ten minste 70 tot 80% zou de blastocyst stadium bereiken in optimale kweekomstandigheden.
Het is aanbevolen dat je een controle groep (stro) van de eicellen / embryo 'in elke bevriezing experiment en dat ook u ontdooien deze groep voordat de rest van de eicellen / embryo's worden gebruikt voor verdere manipulaties. Als de overlevingskans voor de controle groep zijn lager dan verwacht, dooi een andere stro van dezelfde partij. Als de overlevingskans voor deze tweede groep zijn ook laag, gooi de resterende rietjes uit deze bevriezing veel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met dit protocol hamster eicellen en embryo's muis met succes kan worden ingevroren. Eenmaal bevroren, kunnen eicellen / embryo's worden opgeslagen in vloeibare stikstof tanks voor onbepaalde tijd en teruggewonnen op elk gewenst moment of plaats gewenst. Dit biedt het voordeel van het hebben van monsters bijna klaar voor gebruik wanneer dat nodig is. Aan de andere kant kan dit protocol ook gebruikt worden om embryo cryobanks genereren uit waardevolle muizenstammen (zoals transgene lijnen), als een economische en veiliger alternatief voor het behoud van levende dieren kolonies. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol is geoptimaliseerd voor hamster eicellen en hybride B6CBAF1 muizenembryo's cryopreserve. Verschillen in post-dooi overleving bij muizen embryo's met een verschillende genetische achtergronden zijn beschreven 8,9, dus zorg moeten worden genomen om cryopreservatie omstandigheden hebben voor elke soort of stam van eicellen / embryo's en tot het juiste protocol vast te stellen voordat de generatie van de eicel of embryo cryobanks.
Hamster eicellen kunnen worden gebruikt in de menselijke geassisteerde voortplanting clinics voor de sperma penetratie test of voor het sperma-chromosoom analyse 10, of als het beoefenen van materiaal voor beginners in intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Aan de andere kant kan de muis hybride B6CBAF1 embryo's op pronuclear of 2-cel stadia worden gebruikt in de humane geassisteerde voortplanting centra of in onderzoekslaboratoria om de kwaliteit van het embryo cultuur media of de goede werking van de incubators te controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 tot +11.792) en de Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Auteurs willen graag Marc Puigcerver en Jonatan Lucas bedanken voor hun technische bijstand bij de voorbereiding van de media. Alle medewerkers van de Servei d'Estabulari is erkend voor huisvesting van de dieren, en vooral Juan Jose Martin en Javier Benito voor hun extra bijdrage over het opnemen van een deel van deze video. NCB is een fellow van de Portugese Fundação para a Ciência e Tecnologia en SG is een fellow van het Spaanse Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
