Summary
Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.
Abstract
Les embryons et ovocytes ont d'abord été cryoconservés avec succès plus de 30 ans, quand Whittingham
Protocol
Les soins des animaux et des procédures ont été menées selon les directives et règlements approuvés par le Comité d'éthique sur la recherche animale et humaine de l'Universitat Autònoma de Barcelone, en Espagne.
Recueil ovocytaire I.
- Vérifier et sélectionner les hamsters femelles (Mesocricetus auratus; 8-12 semaines est vieux) de la souche d'or syrien pour la présence d'un écoulement épais vaginale (décharge postovulatoire).
- Induire les femmes sélectionnées pour superovulate par injection intrapéritonéale de 40 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) suivi par 40 UI de hCG (gonadotrophine chorionique humaine) 60 heures plus tard.
- Euthanasier les hamsters femelles 16 heures après l'administration de hCG dans une chambre de dioxyde de carbone.
- Isoler oviductes des femelles, comme indiqué dans la vidéo et les transférer à une baisse de KSOM-H moyenne.
- Recueillir ovocyte-cumulus complexes en déchirant l'ampoule tubaire sous un microscope stéréoscopique dans une goutte d'hyaluronidase (156 U / ml) à 37 ° C. Les ovocytes seront libérés par les cellules du cumulus en environ 5 minutes.
- Pick up à partir d'ovocytes hyaluronidase et les laver deux fois dans KSOM-H moyenne.
Pour la collecte d'embryons de souris, les souris femelles (Mus musculus; 6-8 semaines est vieux) sont amenés à superovulate par injection intrapéritonéale de 5 UI de PMSG suivie par 5 UI de hCG 48 heures plus tard et accouplées avec des souris mâles. Les femelles sont sacrifiées par dislocation cervicale p. 24-26, 44-46 ou 54-56 heures après l'administration d'hCG pour l'obtention du pronucléaire, 2-cellules ou embryons au stade 4 cellules, respectivement. Collecte des embryons pronucléaire est réalisée exactement comme décrit pour les ovocytes de hamster. Les embryons au stade 2-cellules et 4-cellules sont collectées par rinçage des oviductes avec KSOM-H moyenne [6].
Note: Suite à ce protocole environ 20 à 30 ovocytes / embryons peuvent être recueillies auprès de chaque femme.
II. Préparation du gel et de dégel des solutions
- Préparer la solution en diluant I 0,57 ml de propilenglycol dans 5 ml de KSOM-H (1,5 M de propilenglycol).
- Préparer la solution de décongélation en ajoutant 2 ml de KSOM-H à un tube avec 0,2052 g de saccharose (0,3 M de saccharose).
- Préparer la solution de gel en ajoutant 2 ml de solution de I à un tube avec 0,0684 g de saccharose (1,5 M de propilenglycol et 0,1 M de saccharose).
Note: Je Solution et gel et de dégel des solutions doivent être préparées juste avant leur utilisation. Toutefois, les montants spécifiés de saccharose à être utilisé pour la préparation du gel et de dégel des solutions peuvent être pondérées à l'avance et stockées dans 3 ml de tubes à température ambiante pendant plusieurs mois.
III. Protocole de congélation
- Ovocytes Transfert / embryons à partir du milieu KSOM-H à une goutte de solution de I et incuber pendant 7-15 minutes à température ambiante.
- Pendant ce temps, préparer une boîte de Petri de 90 mm pour charger les pailles en plaçant 90 gouttes ul du gel et de dégel des solutions comme il est montré dans la vidéo (1 goutte de chaque solution / paille).
- Transférer le nombre souhaité d'ovocytes / embryons aux gouttes solution de congélation.
Note: Nous transfèrent habituellement entre 5 à 30 ovocytes ou d'embryons / déposer. - Attacher une paille pour un système d'aspiration contrôlée bouche et le charger suivant cet ordre: la solution, je, l'air, chute de la congélation des ovocytes avec, l'air, chute de dégel, de l'air.
- Une fois que la paille est chargé, continuez jusqu'à la chute de l'aspiration première fois (solution I) atteint le polymère à l'extrémité supérieure de la paille et les joints à cette fin. Thermo-joint l'autre bout de la paille ou les sceller avec un bouchon en plastique.
- Mettez le congélateur programmable et sélectionnez le programme de congélation. Le programme de congélation utilisé dans ce protocole est basé sur le taux de refroidissement initialement publié par Lassalle et al. [7]:
- 2 ° C / min de la température ambiante à -7 ° C
0 ° C / min pendant 10 min pour permettre l'équilibrage de température et de l'induction de l'ensemencement (voir ci-dessous) - 0,3 ° C / min de -7 ° C à -30 ° C
0 ° C / min pendant 2 min pour permettre l'équilibrage de température - 35 ° C / min de -30 ° C à -130 ° C
- 2 ° C / min de la température ambiante à -7 ° C
- Chargez les pailles sur les fentes de la porte du congélateur programmable, en s'assurant que la partie de la paille avec la goutte de solution de décongélation est orientée vers l'extérieur. Démarrez le programme de congélation.
- Lorsque la température de l'échantillon atteint -7 ° C et le refroidissement est en attente, effectuer le semis manuel: plonger la pince dans l'azote liquide, tirez sur la porte un peu hors du congélateur pour exposer la partie de la paille contenant les gouttes de solution de dégel, et immédiatement toucher cette partie de la paille avec la pince. Répétez l'opération pour chaque titulaire et chaque paillette dans le support, puis laisser le programme de congélation jusqu'à la fin.
- Lorsque le programme est terminé, plongent les porteurs dans l'azote liquide.
- Retirer les pailles de lales titulaires et les transférer à un gobelet étiqueté.
- Enfin, rangez le gobelet intérieur d'un réservoir d'azote liquide.
IV. Le dégel du protocole
- Retirer la paille du réservoir d'azote liquide.
- Maintenir la paille à température ambiante pendant 40 secondes.
- Faire tremper la paille dans un bain-marie à 30 ° C pendant 40 secondes.
- Enlevez le bouchon de la paille ou couper le bout thermo-scellés.
- Videz la paille dans un plat de 35 mm de Pétri et mélanger délicatement les deux gouttes contenant le gel et le dégel des solutions.
- Laisser ovocytes / embryons dans le mélange pendant 15 minutes à température ambiante.
- Transfert des ovocytes / embryons à une baisse des frais KSOM-H pour 15 minutes supplémentaires à 37 ° C.
- Ovocytes / embryons sont maintenant prêts pour d'autres manipulations.
Remarque: Pendant les étapes 6 et 7 vous devriez voir que les ovocytes décongelés / embryons lentement gonfler à cause de la réhydratation.
Résultats Représentant V.
L'utilisation du protocole de cryoconservation rapportés ici en résulte un taux de survie d'environ 95% des ovocytes de hamster et de> 90%, 85% et 80% pour la souris B6CBAF1 embryons au pronucléaire, 2 cellules-étapes et 4 cellules, respectivement. Lorsque des embryons de souris sont cultivées in vitro dans KSOM après décongélation, au moins 70 à 80% devrait atteindre le stade de blastocyste dans des conditions optimales de culture.
Il est recommandé d'inclure un groupe témoin (paille) des ovocytes / embryons dans chaque expérience de congélation et de dégel que vous ce groupe avant que le reste des ovocytes / embryons sont utilisés pour des manipulations supplémentaires. Si les taux de survie pour le groupe contrôle sont plus faibles que prévu, décongeler une autre de paille provenant du même lot. Si les taux de survie pour ce second groupe sont également faibles, jeter le reste des pailles provenant de ce lot de gel.
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Discussion
Avec ce protocole d'ovocytes de hamster et d'embryons de souris peuvent être cryoconservés avec succès. Une fois congelés, les ovocytes / embryons peuvent être conservés dans des cuves d'azote liquide indéfiniment et récupérer à tout moment ou le lieu désiré. Ceci offre l'avantage d'avoir des échantillons de presque prêt à utiliser dès que nécessaire. D'autre part, ce protocole peut également être utilisé pour générer cryobanques embryon à partir de souches de souris précieuses (telles que des lignées transgéniques), comme une alternative économique et sûre pour le maintien des colonies d'animaux vivants. Il est important de noter que ce protocole est optimisé pour cryopréservation des ovocytes de hamster et d'embryons de souris hybrides B6CBAF1. Les différences dans les taux de survie après décongélation des embryons de souris de différentes origines génétiques ont été décrits 8,9, donc il faut prendre soin d'évaluer les conditions de cryoconservation sur chaque espèce ou une souche d'ovocytes / embryons et d'établir le protocole approprié avant que la génération d'ovocytes cryobanques embryon ou.
Ovocytes de hamster peuvent être utilisés en médecine humaine cliniques de procréation assistée pour le test de pénétration des spermatozoïdes ou pour l'analyse des chromosomes des spermatozoïdes 10, ou en tant que pratiquant du matériel pour les débutants dans l'injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). D'autre part, la souris hybrides B6CBAF1 embryons à des stades pronucléaire ou 2-cellule peut être utilisée chez l'homme centres de procréation assistée ou dans les laboratoires de recherche pour vérifier la qualité des milieux de culture d'embryons ou le bon fonctionnement des incubateurs.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Espagnols Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 à 11792) et la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Auteurs tiens à remercier Marc Puigcerver et Jonatan Lucas pour leur assistance technique dans la préparation du support. Tout le personnel de la Estabulari Servei d'est reconnu pour le logement des animaux, et surtout Juan José Martin et Javier Benito, pour leur contribution supplémentaire sur l'enregistrement une partie de cette vidéo. PNE est un membre de la Fundação para portugaise une Ciência e Tecnologia et SG est un fellow de l'Espagne Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
