Summary
In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.
Abstract
Embryonen und Eizellen wurden zunächst erfolgreich mehr als 30 Jahren, kryokonserviert, wenn Whittingham
Protocol
Tierpflege und-verfahren wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durch die Ethikkommission für die Tier-und Human Research der Universitat Autónoma von Barcelona, Spanien zugelassen durchgeführt.
I. Eizellenentnahme
- Prüfen Sie, und wählen weiblichen Hamster (Mesocricetus auratus; 8-12 Wochen alte) der Golden Syrian Belastung für das Vorhandensein einer dicken Ausfluss (postovulatorische Entladung).
- Induce ausgewählten Weibchen durch intraperitoneale Injektion von 40 IE PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), gefolgt von 40 IE hCG (humanes Chorion Gonadotropin) 60 Stunden später superovulate.
- Euthanize weiblichen Hamster 16 Stunden nach der Verabreichung von hCG in einer Kohlendioxid-Kammer.
- Isolieren Eileiter von den Weibchen wie in dem Video gezeigt und sie auf einen Tropfen KSOM-H-Medium.
- Sammeln Oozyten-Cumulus-Komplexe durch Reißen des Eileiters Ampulle unter einem Stereomikroskop in einem Tropfen Hyaluronidase (156 U / ml) bei 37 ° C. Eizellen werden von Cumulus-Zellen in ca. 5 Minuten befreit werden.
- Pick up Oozyten von Hyaluronidase und waschen Sie sie zweimal in KSOM-H-Medium.
Für die Sammlung von Maus-Embryonen, weibliche Mäuse (Mus musculus; 6-8 Wochen alten) induziert werden, um durch intraperitoneale Injektion von 5 IU PMSG von 5 IU hCG 48 Stunden später und folgte gepaart mit männlichen Mäusen superovulate. Die Weibchen sind durch Genickbruch bei 24-26 geopfert, 44-46 oder 54-56 Stunden nach der Gabe von hCG zur Gewinnung von pronukleären, 2-Zell-oder 4-Zellen-Stadium eines Embryos beziehungsweise. Sammlung pronukleären Embryonen ist genau so, wie für Hamster-Oozyten beschrieben durchgeführt. Embryonen im 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium werden durch Spülung der Eileiter mit KSOM-H-Medium [6] gesammelt.
Hinweis: Nach diesem Protokoll etwa 20 bis 30 Eizellen / Embryonen können von jedem weiblichen gesammelt werden.
II. Vorbereitung von Einfrieren und Auftauen Lösungen
- Bereiten Lösung, die ich durch Verdünnung 0,57 ml propilenglycol in 5 ml KSOM-H (1,5 M von propilenglycol).
- Bereiten Auftauen Lösung durch Zugabe von 2 ml KSOM-H zu einem Schlauch mit 0,2052 g Saccharose (0,3 M Saccharose).
- Bereiten Sie das Einfrieren durch Zugabe von 2 ml Lösung, die ich zu einem Schlauch mit 0,0684 g Saccharose (1,5 M von propilenglycol und 0,1 M Saccharose).
Hinweis: Lösung I und Einfrieren und Auftauen Lösungen müssen unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt werden. Allerdings können die angegebenen Mengen an Saccharose, um die Herstellung des Einfrieren und Auftauen Lösungen eingesetzt werden im Vorfeld abgewogen werden und in 3 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur für mehrere Monate.
III. Freezing-Protokoll
- Transfer-Oozyten / Embryonen aus der KSOM-H-Medium zu einem Rückgang der Lösung I und Inkubation für 7-15 Minuten bei Raumtemperatur.
- In der Zwischenzeit bereiten eine 90 mm Petrischale die Strohhalme, indem 90 ul Tropfen Einfrieren und Auftauen Lösungen, wie es in dem Video (1 Tropfen jeder Lösung / Stroh) gezeigt wird geladen.
- Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Eizellen / Embryonen auf das Einfrieren Lösung sinkt.
Hinweis: Wir in der Regel zwischen 5 bis 30 Eizellen oder Embryonen / Drop übertragen. - Bringen Sie einen Strohhalm, um einen Mund gesteuert Absaugsystem und laden Sie sie in dieser Reihenfolge: Lösung I-, Luft-, Gefrier-Drop mit der Eizellen-, Luft-, Auftau-drop, Luft.
- Nachdem das Stroh eingelegt ist, halten Absaugen, bis der erste Tropfen eingeführt (Lösung I) erreicht das Polymer am oberen Ende des Strohs und dichtet diese zu beenden. Thermo-Dichtung das andere Ende des Strohs oder Siegel mit einem Kunststoff-Stopfen.
- Schalten Sie die programmierbare Gefrierschrank und wählen Sie das Einfrieren Programm. Das Einfrieren Programm im Sinne dieses Protokolls ist auf der Kühlraten ursprünglich von Lassalle et al veröffentlicht wurde. [7]:
- 2 ° C / min von Raumtemperatur bis -7 ° C
0 ° C / min für 10 min bis zum Temperaturausgleich und Induktion der Aussaat zu ermöglichen (siehe unten) - 0,3 ° C / min von -7 ° C bis -30 ° C
0 ° C / min für 2 min zum Temperaturausgleich ermöglichen - 35 ° C / min von -30 ° C bis -130 ° C
- 2 ° C / min von Raumtemperatur bis -7 ° C
- Laden Sie die Strohhalme auf die Schlitze des Inhabers der programmierbaren Gefrierfach, um sicherzustellen, dass der Teil des Strohs mit dem Tropfen Auftauen Lösung ist nach außen. Starten Sie das Einfrieren Programm.
- Wenn Probentemperatur -7 ° C und die Kühlung auf Eis erreicht, eine manuelle Aussaat: Planschbecken der Zange in flüssigen Stickstoff, ziehen Sie den Halter etwas aus der Tiefkühltruhe auf den Teil der Halme mit den Tropfen Auftauen Lösung auszusetzen, und sofort Berühren dieser Teil der Halme mit der Zange. Wiederholen Sie für jeden Halter und jeden Strohhalm in die Halterung, und lassen Sie dann das Einfrieren Programm bis zum Ende laufen.
- Wenn das Programm beendet ist, tauchen die Inhaber in flüssigem Stickstoff.
- Entfernen Sie die Strohhalme aus demInhaber und sie auf ein markiertes gobelet.
- Schließlich speichern Sie die gobelet in einem flüssigen Stickstoff-Tank.
IV. Auftauen Protokoll
- Entfernen Sie das Stroh aus dem flüssigen Stickstoff-Tank.
- Pflegen Sie die Stroh bei Raumtemperatur für 40 Sekunden.
- Weichen Sie das Stroh in einem Wasserbad bei 30 ° C während 40 Sekunden.
- Entfernen Sie den Stecker aus der Stroh oder schneiden Sie die thermo-versiegelte Spitze.
- Leeren Sie den Strohhalm in einer 35-mm-Petrischale und vorsichtig mischen die beiden Tropfen mit dem Einfrieren und Auftauen Lösungen.
- Lassen Eizellen / Embryonen in die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Transfer-Oozyten / Embryonen zu einem frischen Tropfen KSOM-H für weitere 15 Minuten bei 37 ° C.
- Eizellen / Embryonen sind jetzt bereit zur weiteren Bearbeitung.
Hinweis: Während der Schritte 6 und 7 sollten Sie sehen, dass die aufgetauten Eizellen / Embryonen langsam durch Rehydratation anschwellen.
V. repräsentative Ergebnisse
Der Einsatz der Kryokonservierung Protokoll hier berichteten Ergebnisse in eine Überlebensrate von ca. 95% für Hamster-Oozyten und von> 90%, 85% und 80% für Maus B6CBAF1 Embryonen im pronukleären, 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium, beziehungsweise. Wenn Mäuse-Embryonen in vitro sind in KSOM nach dem Auftauen kultiviert, sollte mindestens 70 bis 80% der Blastozysten-Stadium in optimalen Kulturbedingungen zu erreichen.
Es wird empfohlen, dass Sie mit einer Kontrollgruppe (Stroh) von Oozyten / Embryonen in jedem Einfrieren Experiment und dass auch Sie Tauwetter dieser Gruppe vor dem Rest der Eizellen / Embryonen für weitere Manipulationen genutzt werden. Wenn die Überlebensraten für die Kontrollgruppe niedriger als erwartet sind, Tauwetter ein anderes Stroh aus der gleichen Charge. Wenn die Überlebenschancen für diese zweite Gruppe ebenfalls niedrig sind, werfen Sie die verbleibenden Strohhalme aus diesem Einfrieren viel.
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Discussion
Mit diesem Protokoll Hamster-Oozyten-und Maus-Embryonen erfolgreich kryokonserviert werden. Einmal gefroren, können Eizellen / Embryonen in flüssigem Stickstoff Tanks auf unbestimmte Zeit gespeichert und wiederhergestellt werden an jedem Ort und Zeit gewünscht. Dies bietet den Vorteil, dass Proben fast einsatzbereit, wann immer erforderlich. Auf der anderen Seite kann dieses Protokoll auch verwendet, um Embryo Kryobanken aus wertvollen Mausstämme (wie transgenen Linien), wie eine kostengünstige und sichere Alternative für die Aufrechterhaltung des lebenden Tieres Kolonien zu erzeugen. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll ist optimiert, um Hamster-Oozyten-und Hybrid-B6CBAF1 Mausembryonen Kryokonservierung. Unterschiede in der post-Tau-Überlebensrate von Maus-Embryonen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen wurden 8,9 beschrieben, so muss darauf geachtet werden, um die Kryokonservierung Bedingungen auf jede Art und Stamm Eizellen / Embryonen zu bewerten und das entsprechende Protokoll vor der Erzeugung der Eizelle etablieren oder der Embryo Kryobanken.
Hamster-Oozyten können in menschlichen assistierten Reproduktion Kliniken für die Spermien Penetrationstest oder Spermien Chromosomenanalyse 10, oder als Übungsmaterial für Anfänger in intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) verwendet werden. Auf der anderen Seite, können Maus-Hybrid B6CBAF1 Embryonen pronukleären oder 2-Zell-Stadium in der menschlichen assistierten Reproduktion Zentren oder in Forschungslabors verwendet werden, um die Qualität des Embryos Kulturmedien oder das ordnungsgemäße Funktionieren der Inkubatoren zu überprüfen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der spanischen Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) und der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Autoren möchten Marc Puigcerver und Jonatan Lucas für ihre technische Unterstützung danken, bei der Vorbereitung der Medien. Alle Mitarbeiter aus dem Servei d'Estabulari ist für Tierhaltung anerkannt, und vor allem Juan Jose Martin und Javier Benito für ihre zusätzlichen Beitrag zur Aufzeichnung Teil dieses Video. NZB ist ein Fellow des portugiesischen Fundação para a Ciência e Tecnologia und SG ist ein Fellow des spanischen Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
