Summary
במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.
Abstract
עוברים וביציות היו הראשונים cryopreserved בהצלחה יותר מ -30 שנים, כאשר Whittingham
Protocol
טיפול בבעלי חיים ונהלים נערכו על פי הנחיות ותקנות שאושרו על ידי ועדת האתיקה על בעלי חיים ומחקר האדם של אוניברסיטת האוטונומית של ברצלונה, ספרד.
אני אוסף הביצית
- בדוק ובחר אוגרים הנקבה (Mesocricetus auratus; 8-12 בשבוע הישן) של זן הסורי הזהב עבור נוכחות של הפרשות הנרתיק עבה (פריקה postovulatory).
- לגרום לנקבות שנבחרו superovulate בזריקה intraperitoneal של 40 IU של PMSG (בהריון Mare סרום גונדוטרופין) ואחריו 40 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) 60 שעות לאחר מכן.
- להרדים אוגרים הנקבה 16 שעות לאחר מתן hCG בתא פחמן דו חמצני.
- בודד oviducts מן הנקבות כפי שמוצג בסרטון ולהעבירם ירידה של המדיום KSOM-H.
- איסוף הביצית-תלולית על ידי מתחמי קריעת ampulla oviduct תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופית ירידה של hyaluronidase (156 U / ml) בשעה 37 ° C. ביציות יתפנה מן התאים קומולוס בתוך כ 5 דקות.
- תרימי ביציות מן hyaluronidase ולשטוף אותם פעמיים בינוני KSOM-H.
עבור אוסף של עוברי עכברים, נקבות עכברים (Mus שריר: 6-8 בשבוע הישן) הם המושרה על ידי הזרקה superovulate intraperitoneal של 5 IU של PMSG ואחריו 5 IU של hCG 48 שעות מאוחר יותר הזדווגו עם עכברים זכרים. נקבות מוקרבים על ידי נקע בצוואר הרחם ב 24-26, 44-46 או 54-56 שעות לאחר מתן של hCG עבור obtention של pronuclear, 2 תאים או 4 תאים עוברים שלב, בהתאמה. אוסף של עוברים pronuclear מתבצעת בדיוק כפי שתואר עבור ביציות אוגר. עוברים בשלבים 2 תאים ו 4 תאים נאספים על ידי שטיפה עם oviducts בינוני KSOM-H [6].
הערה: בעקבות פרוטוקול זה כ 20-30 ביציות / עוברים ניתן לאסוף מן הנקבה כל אחד.
השנייה. הכנת מקפיא הפשרה פתרונות
- הכן פתרון אני על ידי דילול 0.57 מ"ל של propilenglycol ב 5 מ"ל של KSOM-H (1.5 מ 'של propilenglycol).
- הכן פתרון הפשרה על ידי הוספת 2 מ"ל של KSOM-H לצינור עם סוכרוז 0.2052 גרם (0.3 מ 'של סוכרוז).
- הכן פתרון הקפאת ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת אני לצינור עם סוכרוז 0.0684 גרם (1.5 מ 'של propilenglycol ו 0.1 סוכרוז M).
הערה: אני פתרון מקפיא הפשרה הפתרונות צריכים להיות מוכנים רק לפני השימוש בהם. עם זאת, הסכומים המפורטים של סוכרוז לשמש להכנת הקפאת פתרונות הפשרה עשוי להיות משוקלל מראש ומאוחסנים 3 מ"ל שפופרות בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים.
ג. הקפאת פרוטוקול
- העברת ביציות / עוברים ממדיום KSOM-H ירידה של פתרון ואני דגירה של 7-15 דקות בטמפרטורת החדר.
- בינתיים, להכין צלחת פטרי 90 מ"מ כדי לטעון את קשיות ידי הצבת 90 טיפות של μl מקפיא הפשרה פתרונות כמו זה המוצג בסרטון (1 טיפה של כל פתרון / קש).
- מעבירים את המספר הרצוי של ביציות / עוברים את טיפות פתרון מקפיא.
הערה: אנו בדרך כלל העברה בין 5-30 ביציות או עוברים / ירידה. - צרף קש למערכת שאיפה לשלוט בפה לטעון אותו הבאים בסדר הזה: הפתרון אני, אוויר, ירידה הקפאה עם ביציות, אוויר, ירידה הפשרה, אוויר.
- לאחר קש נטען, לשמור aspirating עד הטיפה הראשונה הציג (פתרון אני) מגיע פולימר בקצה העליון של הקשית וחותמות הזה סוף. Thermo-חותם את הקצה השני של קש או חותם עם פקק פלסטיק.
- הפעל את במקפיא לתכנות ובחר את תוכנית ההקפאה. תוכנית הקפאת בשימוש פרוטוקול זה מבוסס על שיעורי קירור פורסם במקור על ידי לאסאל et al. [7]:
- 2 ° C / min מ בטמפרטורת החדר ל -7 ° C
0 ° C / min 10 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה של זריעת אינדוקציה (ראה להלן) - 0.3 ° C / min מ -7 ° C ל -30 ° C
0 ° C / min 2 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה - 35 ° C / min מ -30 ° C ל -130 ° C
- 2 ° C / min מ בטמפרטורת החדר ל -7 ° C
- טען את קשיות על החריצים של בעל במקפיא לתכנות, ולוודא כי החלק של קש עם ירידה של פתרון הפשרה פונה כלפי חוץ. הפעל את תוכנית ההקפאה.
- כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -7 מדגם ° C וקירור בהמתנה, לבצע זריעה ידנית: לצלול מלקחיים לתוך חנקן נוזלי, למשוך את מחזיקי מעט מהמקפיא כדי לחשוף את החלק של קשיות המכיל את טיפות פתרון הפשרה, ומיד המגע החלק הזה של קשיות עם מלקחיים. חזור לבעל ולכל קש בעל ולאחר מכן אפשר להריץ את תוכנית ההקפאה עד הסוף.
- כאשר התוכנית תושלם, לצלול בעלי בחנקן נוזלי.
- הסר את קשיות מןמחזיקי ולהעבירם gobelet שכותרתו.
- לבסוף, בחנות gobelet בתוך טנק חנקן נוזלי.
IV. הפשרה פרוטוקול
- הסר את קש מהטנק חנקן נוזלי.
- שמור על קש בטמפרטורת החדר למשך 40 שניות.
- משרים את קש באמבט מים ב 30 ° C במשך 40 שניות.
- הסר את תקע מתוך קש או לחתוך את קצה תרמו אטום.
- רוקן את קש בצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ בעדינות מערבבים את שתי טיפות המכילות את המקפיא הפשרת פתרונות.
- השאירו ביציות / עוברים בתערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- העברת ביציות / עוברים לירידה טרי KSOM-H על 15 דקות נוספות ב 37 ° C.
- ביציות / עוברים כעת מוכן מניפולציה נוספת.
הערה: במהלך שלבים 6 ו -7 אתה צריך לראות כי ביציות מופשר / עוברים לאט להתנפח עקב התייבשות.
V. תוצאות נציג
השימוש בפרוטוקול cryopreservation דיווחו כאן התוצאה היא שיעור הישרדות של כ 95% עבור ביציות אוגר של 90%>, 85% ו 80% עבור B6CBAF1 עוברי עכברים בבית pronuclear, 2 תאים בשלבים 4 תאים, בהתאמה. כאשר עוברי עכברים הם מתורבתים במבחנה ב KSOM לאחר ההפשרה, לפחות 70 עד 80% צריך להגיע לשלב הבלסטוציסט בתנאים אופטימליים תרבות.
מומלץ לכלול קבוצת ביקורת (קש) של ביציות / עוברים כל ניסוי מקפיא שאתה להפשיר את הקבוצה הזאת לפני שאר ביציות / עוברים משמשים מניפולציות נוספות. אם שיעורי ההישרדות בקבוצת הביקורת נמוכים מהצפוי, להפשיר עוד קש ממגרש אותו. אם שיעורי ההישרדות של הקבוצה השנייה הם גם נמוכים, לבטל את קשיות הנותרים ממגרש זה מקפיא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם ביציות זה אוגר פרוטוקול עוברי עכבר ניתן cryopreserved בהצלחה. קפוא פעם, ביציות / עוברים ניתן לאחסן מכלי חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן והחלים בכל זמן או מקום הרצוי. זו מציעה את היתרון שיש דגימות כמעט מוכנה להשתמש בכל פעם לפי הצורך. מצד שני, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לייצר cryobanks העובר מן הזנים העכבר ערך (כגון קווי מהונדס), כחלופה חסכוני ובטוח יותר לשמירה על מושבות חיים לחיות. חשוב לציין כי פרוטוקול מותאם cryopreserve ביציות אוגר היברידית עוברי עכבר B6CBAF1. הבדלים שלאחר ההפשרה שיעורי ההישרדות בקרב עוברי עכבר עם רקע גנטי שונה תוארו 8,9, ולכן יש להיזהר כדי להעריך את התנאים cryopreservation על כל זן של המין או ביציות / עוברים להקים את הפרוטוקול המתאים לפני הדור של הביצית או העובר cryobanks.
ביציות אוגר ניתן להשתמש אנושי מרפאות רבייה סייעה לבדיקה חדירת זרע או לניתוח הזרע כרומוזום 10, או כמו לתרגל חומר למתחילים הזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI). מצד שני, היברידית עכבר B6CBAF1 עוברים בשלבים pronuclear או 2 תאים ניתן להשתמש בסיוע אנושי מרכזי רבייה או במעבדות מחקר כדי לבדוק את האיכות של תרבות התקשורת העובר או את התפקוד התקין של החממות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio ספרדית דה Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) ואת Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מבקשים להודות מארק Puigcerver ואת יונתן לוקאס לקבלת סיוע טכני שלהם בהכנת התקשורת. כל הצוות של ד 'Servei Estabulari הוא הודה לדיור בעלי חיים, ובעיקר חואן חוסה מרטין חבייר בניטו על תרומה נוספת על הקלטה של וידאו חלק זה. NCB הוא עמית של Fundação פורטוגזית פסקה דואר Ciência Tecnologia ו SG הוא עמית של הספרדי Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
