Summary
इस वीडियो लेख में हम कदम दर कदम कैसे इकट्ठा करने के लिए और उच्च पद पिघलना जीवित रहने की दरों के साथ हम्सटर oocytes cryopreserve पर एक प्रदर्शन प्रस्तुत करते हैं. एक ही प्रक्रिया भी सफलतापूर्वक स्थिर और पिघलना preimplantation विकास के विभिन्न चरणों पर माउस भ्रूण के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
पशु देखभाल और प्रक्रियाओं बार्सिलोना, स्पेन के विश्वविद्यालय ऑटोनोमा के पशु और मानव अनुसंधान पर आचार समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार आयोजित की गई.
I. Oocyte संग्रह
- की जाँच करें और महिला hamsters के (Mesocricetus auratus; 8-12 सप्ताह पुराने) का चयन एक मोटी योनि स्राव (postovulatory निर्वहन) की उपस्थिति के लिए गोल्डन सीरिया के तनाव के.
- चयनित महिलाओं को प्रेरित PMSG के 40 IU intraperitoneal इंजेक्शन (गर्भवती Mare सीरम gonadotropin) एचसीजी (मानव chorionic gonadotropin) के 40 आइयू द्वारा पीछा द्वारा 60 घंटे बाद superovulate.
- एक कार्बन डाइऑक्साइड के चैम्बर में एचसीजी के प्रशासन के बाद 16 घंटे महिला हैम्स्टर्स euthanize.
- जैसा कि वीडियो में दिखाया गया है महिलाओं से oviducts अलग करने और उन्हें KSOM - एच माध्यम की एक बूंद को हस्तांतरण.
- Hyaluronidase (156 यू / एमएल) की एक बूंद में एक त्रिविम खुर्दबीन के नीचे oviduct ampulla फाड़ द्वारा 37 oocyte-मेघपुंज परिसरों लीजिए डिग्री सेल्सियस Oocytes मेघपुंज कोशिकाओं से लगभग 5 मिनट में मुक्त हो जाएगा.
- Hyaluronidase से oocytes उठाओ और उन्हें KSOM एच मध्यम में दो बार धोने.
माउस भ्रूण के संग्रह के लिए, मादा चूहों (मुसलमानों मस्कुलस, 6-8 हफ्ते पुरानी है) PMSG एचसीजी 48 घंटे के 5 IU द्वारा बाद में पीछा किया और नर चूहों के साथ mated 5 IU की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा superovulate के लिए प्रेरित कर रहे हैं. महिलाओं गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से 24-26 पर बलिदान कर रहे हैं, 44-46 या 54-56 घंटे pronuclear, 2 कक्ष या 4 सेल भ्रूण चरण, क्रमशः की obtention के लिए एचसीजी के प्रशासन के बाद. Pronuclear भ्रूण के संग्रह वास्तव में किया जाता है के रूप में हम्सटर oocytes के लिए वर्णित है. 2 सेल और 4 सेल के चरणों में भ्रूण KSOM एच [6] मध्यम के साथ oviducts निस्तब्धता से एकत्र कर रहे हैं.
नोट: इस प्रोटोकॉल के बाद लगभग 20 से 30 oocytes / भ्रूण प्रत्येक महिला से एकत्र किया जा सकता है है.
द्वितीय. ठंड और विगलन समाधान की तैयारी
- समाधान तैयार मैं KSOM एच (propilenglycol के 1.5 एम) के 5 मिलीलीटर में propilenglycol के 0.57 मिलीलीटर गिराए.
- विगलन समाधान 0.2052 ग्राम sucrose (sucrose के 0.3 एम) के साथ एक ट्यूब के लिए KSOM एच के 2 मिलीलीटर जोड़कर तैयार करें.
- ठंड समाधान .०६८४ छ sucrose (1.5 propilenglycol और 0.1 एम sucrose के एम) के साथ एक ट्यूब के लिए मैं समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर तैयार करें.
नोट: समाधान मैं और ठंड और विगलन समाधान सिर्फ उनके उपयोग से पहले तैयार रहना चाहिए . हालांकि, sucrose के निर्दिष्ट मात्रा में ठंड और विगलन के समाधान की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा अग्रिम में भारित किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर 3 - मिलीलीटर ट्यूबों में कई महीनों के लिए भंडारित किया.
III. बर्फ़ीली प्रोटोकॉल
- स्थानांतरण oocytes / KSOM एच माध्यम से मैं समाधान की एक बूंद के लिए और कमरे के तापमान पर 7-15 मिनट के लिए सेते भ्रूण.
- इस बीच, एक 90 मिमी पेट्री डिश तैयार करने के लिए ठंड और विगलन के समाधान के 90 μl बूँदें रखने के रूप में यह वीडियो में दिखाया गया है (प्रत्येक समाधान / पुआल की एक बूंद) द्वारा तिनके लोड.
- Oocytes / भ्रूण की वांछित संख्या ठंड समाधान बूंदों के लिए स्थानांतरण.
नोट: हम आमतौर पर 5 से 30 oocytes या भ्रूण / ड्रॉप के बीच स्थानांतरण . - एक मुँह नियंत्रित आकांक्षा प्रणाली के लिए एक भूसे संलग्न और यह इस आदेश के बाद लोड: मैं, हवा, oocytes, हवा, विगलन बूंद, हवा के साथ ठंड ड्रॉप समाधान.
- एक बार पुआल भरी हुई है, aspirating जब तक पहले ड्रॉप (मैं समाधान) शुरू पुआल और यह अंत के जवानों के शीर्ष के अंत में बहुलक तक पहुँचता है रहते हैं. थर्मो मुहर भूसे या एक प्लास्टिक प्लग के साथ सील के दूसरे छोर.
- प्रोग्राम फ्रीजर पर स्विच और ठंड प्रोग्राम का चयन करें. ठंड इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता कार्यक्रम ठंडा मूल Lassalle एट अल द्वारा प्रकाशित दरों पर आधारित है. : [7]
- 2 ° C / -7 के लिए कमरे के तापमान से मिनट डिग्री सेल्सियस
0 ° सी / 10 मिनट के लिए मिनट तापमान और बोने के संतुलन शामिल होने के लिए अनुमति देने के लिए (नीचे देखें) - 0.3 ° सी -7 से / मिनट ° सी -30 ° C
0 ° सी / 2 मिनट के लिए मिनट तापमान संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए - 35 ° C / मिनट -30 ° C से -130 डिग्री सेल्सियस
- 2 ° C / -7 के लिए कमरे के तापमान से मिनट डिग्री सेल्सियस
- प्रोग्राम फ्रीजर के धारक के स्लॉट पर तिनके लोड, सुनिश्चित करें कि विगलन समाधान की गिरावट के साथ पुआल का हिस्सा बाहर का सामना करना पड़ रहा है. ठंड प्रोग्राम को प्रारंभ करें.
- जब नमूना तापमान -7 ° सी और ठंडा पकड़ पर पहुँचता है, मैनुअल बोने प्रदर्शन: संदंश तरल नाइट्रोजन में डुबकी, थोड़ा बाहर फ्रीजर के धारकों खींच समाधान विगलन की बूँदें युक्त तिनके का हिस्सा बेनकाब करने के लिए, और तुरंत संदंश के साथ तिनके के इस भाग को स्पर्श. प्रत्येक धारक में प्रत्येक पुआल धारक के लिए दोहराएँ, और तब ठंड अंत तक चलाने के कार्यक्रम.
- जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, तरल नाइट्रोजन में धारकों डुबकी.
- से तिनके निकालेंधारकों और उन्हें एक लेबल gobelet के लिए स्थानांतरण.
- अंत में, एक तरल नाइट्रोजन टैंक के अंदर gobelet दुकान.
चतुर्थ. प्रोटोकॉल विगलन
- तरल नाइट्रोजन टैंक से पुआल निकालें.
- कमरे के तापमान पर 40 सेकंड के लिए पुआल को बनाए रखें.
- एक पानी के स्नान में 30 ° C पर 40 सेकंड के दौरान भूसे भिगोएँ.
- पुआल से प्लग निकालें या थर्मामीटरों - मोहरबंद टिप कटौती.
- एक 35 मिमी पेट्री डिश में खाली पुआल और धीरे ठंड युक्त और समाधान विगलन दो बूँदें मिश्रण.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण में / oocytes भ्रूण छोड़ दें.
- KSOM - एच के एक ताजा ड्रॉप करने के लिए oocytes भ्रूण / 37 पर एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
- / Oocytes भ्रूण अब आगे हेरफेर के लिए तैयार हैं.
नोट: आप कदम 6 और 7 के दौरान देखना चाहिए कि thawed oocytes / भ्रूण धीरे ऊपर पुनर्जलीकरण करने के लिए कारण प्रफुल्लित .
वी. प्रतिनिधि परिणाम
cryopreservation के प्रोटोकॉल का उपयोग यहाँ हम्सटर oocytes के लिए लगभग 95% और> 90%, 85% और pronuclear, दो सेल और 4 सेल चरणों पर माउस B6CBAF1 भ्रूण के लिए 80%, क्रमशः के जीवित रहने की दर में परिणाम की सूचना दी. जब माउस भ्रूण KSOM में इन विट्रो में विगलन के बाद संवर्धित कर रहे हैं, कम से कम 70 80% इष्टतम संस्कृति स्थितियों में ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुँचने चाहिए.
यह अनुशंसित है कि आप oocytes / भ्रूण के नियंत्रण (पुआल) प्रत्येक ठंड प्रयोग में और उस समूह में शामिल आप इस समूह का पिघलना oocytes / भ्रूण के बाकी से पहले आगे जोड़तोड़ के लिए उपयोग किया जाता है. यदि नियंत्रण समूह के लिए जीवित रहने की दर अपेक्षा से कम हैं, एक ही बहुत से अन्य पुआल पिघलना. यदि इस दूसरे समूह के लिए जीवित रहने की दरों को भी कम हैं, इस ठंड बहुत से शेष तिनके त्यागें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल हम्सटर oocytes और माउस भ्रूण सफलतापूर्वक cryopreserved किया जा सकता है. एक बार जम / oocytes और भ्रूण तरल नाइट्रोजन टैंक में अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है और किसी भी समय या जगह वांछित पर बरामद किया. यह नमूने लगभग उपयोग करने के लिए जब भी जरूरत के लिए तैयार होने का लाभ प्रदान करता है. दूसरी ओर, इस प्रोटोकॉल भी मूल्यवान माउस (जैसे ट्रांसजेनिक लाइनों के रूप में) जीवित पशु कालोनियों के रखरखाव के लिए एक किफायती और सुरक्षित विकल्प के रूप में उपभेदों से भ्रूण cryobanks उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल हम्सटर oocytes और संकर B6CBAF1 माउस भ्रूण cryopreserve करने के लिए अनुकूलित है है. बाद पिघलना जीवित रहने की दरों में अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ माउस भ्रूण के बीच अंतर 8,9 में वर्णित किया गया है, इस तरह देखभाल के लिए प्रत्येक प्रजाति या oocytes / भ्रूण के तनाव पर cryopreservation की स्थिति का आकलन और oocyte पीढ़ी के पहले उचित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए लिया जाना चाहिए या भ्रूण cryobanks.
हम्सटर oocytes शुक्राणु प्रवेश परीक्षा के लिए या शुक्राणु गुणसूत्र 10 के विश्लेषण के लिए, या शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई) में beginners के लिए सामग्री का अभ्यास के रूप में मानव सहायता प्रजनन क्लीनिक में इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरी ओर, माउस pronuclear या 2 सेल चरणों में संकर भ्रूण B6CBAF1 के मानवीय सहायता प्रजनन केंद्रों में या अनुसंधान प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है भ्रूण संस्कृति मीडिया या इन्क्यूबेटरों के समुचित कार्य के की गुणवत्ता की जांच करने के लिए.
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Acknowledgments
यह काम स्पेनिश Ministerio डे Educación y (2006-11,792 जैव) Ciencia और Generalitat de Catalunya (2005 SGR00437) द्वारा समर्थित किया गया. लेखक के लिए उनके तकनीकी सहायता के लिए मीडिया की तैयारी में मार्क Puigcerver और Jonatan लुकास धन्यवाद देना चाहूंगा. Servei d'Estabulari से सभी कर्मचारियों को जानवरों के आवास के लिए स्वीकार किया है, और विशेष रूप से जुआन जोस मार्टिन और उनके अतिरिक्त योगदान के लिए इस वीडियो का हिस्सा रिकॉर्डिंग पर जेवियर बेनिटो. एनसीबी पुर्तगाली Fundação पैरा के एक साथी है Ciência ई TECNOLOGIA और एसजी स्पेनिश Ministerio डे Educación y Ciencia के एक साथी है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
