コレクションとハムスターの卵母細胞とマウス胚の凍結保存
Summary
このビデオ、記事では、高解凍後の生存率とハムスターの卵母細胞を収集し、凍結保存する方法についてステップバイステップのデモンストレーションを提示する。同じ手順でもうまく着床前の発達の異なる段階でマウスの胚を凍結融解に適用することができます。
Abstract
時ウィッティンガム胚および卵母細胞が最初に成功し、30年以上前に凍結保存した<i>ら。</i><sup> 1</sup>とウィルムット<sup> 2</sup>別々にパークニング、マウスの胚は° Cと、数年後に-196で凍結して保存することができることが記載<i>ら</i>。<sup> 3</sup>凍結卵母細胞の体外受精（IVF）に起因するライブ子孫の誕生を報告した。それ以来、凍結保存技術の使用は急速に、ヒトと動物の生殖補助の実施及び動物遺伝資源の保全に不可欠なコンポーネントになるために広がっている。緩慢凍結とガラス化：現在のところ、卵母細胞および胚を凍結保存するために使用される2つの主な方法があります。アプローチの多種多様な子どもたちの動物と何千もの両方の技術と数百万人が凍結胚から生まれてきた改善しようとするために使用されている。しかし、凍結保存に関連する重要な欠点は、まだ氷結晶の形成以来、克服しなければならない、ソリューションの効果と浸透圧ショック後の融解卵母細胞および胚におけるいくつかのcryoinjuriesを引き起こすようです。プログラム可能な冷凍庫で緩慢凍結は、通常、化学物質の毒性および浸透圧ショックに関連付けられている凍結防止剤、低濃度を使用する利点がありますが、低濃度での氷結晶の形成を避けるために、彼らの能力は限られている。緩慢凍結では、手動または自動シーディングを使用して避けなければならない冷却効果を誘発する<sup> 4</sup>。ガラス化の過程においては、凍結保護剤の高濃度は、氷結晶の形成を阻害し、水が固化されているガラスのようなガラス固化体状態の形成につながるが、展開されません。しかし、使用される濃度でcyroprotectantsの毒性のために、卵母細胞/胚は、直接液体窒素でサンプルを沈める前に、時間のと最小容積の溶液中で非常に短い期間のために凍結保護ソリューションに公開することができます<sup> 5</sup>。それは高価な機器（プログラマブル冷凍庫）が必要とされている非常に迅速な方法であるため、過去10年間では、ガラス化は、より一般的になってきている。しかし、緩慢凍結では、卵母細胞/胚凍結保存のための最も広く使われている方法であり続けている。このビデオ、記事では、収集し、徐々に高解凍後の生存率とハムスターの卵母細胞を凍結する方法を、ステップバイステップ、を示しています。同じ手順でもうまく着床前の発達の異なる段階でマウスの胚を凍結融解に適用することができます。
Protocol
Discussion
このプロトコルでハムスターの卵母細胞およびマウス胚は、正常に凍結保存することができます。一度凍結、卵母細胞/胚が無期限に液体窒素タンクに貯蔵し、必要に応じて任意の時間または場所で回収することができます。これにより、必要なときに使用する準備がほぼ試料を有するという利点を提供しています。一方、このプロトコルはまた、生きた動物のコロニーの維持に経済的かつ安全な代替として…
Acknowledgements
この作品は、スペイン語MinisterioデEducación Y Ciencia（BIO 2006から11792）とのGeneralitat de Catalunyaの（2005 – SGR00437）によってサポートされていました。著者は、メディアを準備する彼らの技術支援のためのMarc Puigcerverとジョナタンルーカスに感謝します。 ServeiドールEstabulariからすべてのスタッフは動物の住宅、そしてこのビデオの一部を記録する上での追加の貢献のために特にフアンホセマーティンとハビエルニートのために認められている。 NCBは、 ポルトガル語Fundaçãoパラの仲間Ciência電子TecnologiaとSGはスペイン語MinisterioデEducación Y Cienciaの仲間です。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
