Summary
このビデオ、記事では、高解凍後の生存率とハムスターの卵母細胞を収集し、凍結保存する方法についてステップバイステップのデモンストレーションを提示する。同じ手順でもうまく着床前の発達の異なる段階でマウスの胚を凍結融解に適用することができます。
Abstract
時ウィッティンガム胚および卵母細胞が最初に成功し、30年以上前に凍結保存した
Protocol
動物のケアと手順は、バルセロナ、スペインの理学部自治の動物と人間の研究に倫理委員会で承認されたガイドラインおよび規則に従って行った。
I.卵母細胞のコレクション
- 厚い膣分泌物（排卵後の放電）の存在のためのゴールデンシリアの株の、雌のハムスター（8-12週の古いゴールデンハムスター）を確認して選択します。
- 60時間後にPMSG 40 IUの腹腔内注射（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）HCG（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を40 IUが続くことにより過剰排卵するために選択された女性を誘導する。
- 16時間二酸化炭素室内のhCGの投与後の女性のハムスターを安楽死させる。
- ビデオに示すように雌から卵を隔離し、KSOM - H培地のドロップに移す。
- 37ヒアルロニダーゼのドロップで実体顕微鏡下で卵管膨大部を引き裂くことによって卵母細胞の卵丘複合体（156 U / ml）を集める℃に卵母細胞は、約5分で卵丘細胞から解放されます。
- ヒアルロニダーゼから卵母細胞をピックアップし、KSOM - H培地で二度それらを洗う。
マウス胚の収集のために、雌マウス（ハツカネズミ、6〜8週の古いが）後でhCGの48時間の5 IUが続くと雄マウスと交配PMSGの5 IUの腹腔内注射による過剰排卵するように誘導されています。女性は44から46または54から56時間、それぞれ、前核、2セルまたは4細胞期胚の取得を示しますためにhCGの投与後、24から26で頸椎脱臼により屠殺されています。ハムスターの卵母細胞について記載した前核胚のコレクションが正確に実行されます。 2セルと4セルの段階で胚がKSOM - H培地[6]で卵管をフラッシュすることによって収集されます。
注：このプロトコルに続いて約20〜30卵母細胞/胚は各女性から収集することができます。
II。ソリューションを凍結融解の準備
- KSOM - H（propilenglycolの1.5 M）5mlにpropilenglycolの0.57 mlを希釈することにより、I溶液を準備します。
- 0.2052グラムのショ糖（スクロースの0.3 M）をチューブにKSOM - H 2 mlを添加することにより融解溶液を調製します。
- 私は0.0684グラムのショ糖（propilenglycolと0.1 Mのショ糖の1.5 M）をチューブに溶液2 mlを添加することにより凍結溶液を調製します。
注：ソリューションの私とソリューションを凍結融解はちょうど彼らの使用の前に準備する必要があります。しかし、凍結と融解の溶液の調製に使用するショ糖の指定された金額は、事前に重み付けし、数ヶ月間、室温で3 ML -チューブに格納されることがあります。
III。凍結プロトコル
- 卵母細胞/胚KSOM - H培地からの溶液Iの低下に移転し、室温で7月15日分間インキュベートする。
- 一方、それはビデオ（各ソリューション/わらの1滴）に示すように凍結融解ソリューション90μlの滴を配置することでストローをロードする90ミリメートルのペトリ皿を準備する。
- 凍結液滴に卵母細胞/胚の希望数を転送する。
注：私達は通常5から30卵母細胞または胚/ドロップ間で転送する。 - 口制御吸引システムにわらを添付し、この順序に従って、それをロードする：溶液I、空気、卵母細胞と凍結ドロップ、空気は、ドロップ、空気を解凍。
- ストローがロードされると、最初のドロップは、わらとアザラシこの最後の上端にあるポリマーに達する（溶液I）を導入するまで吸引してください。プラスチック製のプラグと藁やシールのもう一方の端を熱シールします。
- プログラム可能な冷凍庫のスイッチを入れ、凍結プログラムを選択します。このプロトコルで使用されている凍結プログラムは、もともとラサールらによって発表された冷却速度に基づいています。 [7]：
- -7〜室温から2℃/分° C
0℃/ 10分間分播種の温度平衡と誘導を可能にする（下記参照） - -7〜0.3℃/ minで-30 ° CにC
0 ° Cの温度平衡化を可能にするために2分間/分 - 35 ° C / minで-30℃から-130℃まで
- -7〜室温から2℃/分° C
- 融解溶液の液滴とわらの部分が外側に向いていることを確認し、プログラム可能な冷凍庫のホルダーのスロットにストローをロードする。凍結プログラムを起動します。
- サンプルの温度が-7℃、冷却がhold状態にあるに達すると、手動シーディングを実行します。液体窒素に突入する鉗子は、直ちに解決策を融解の滴を含むストローの一部を公開するためにわずかに冷凍庫の所有者を引いて、と鉗子でストローのこの部分に触れてください。ホルダー内の各ホルダーと各わらでも同じ処理を繰り返し、最後まで実行する凍結プログラムをしましょう。
- プログラムが完了すると、液体窒素で所有者を突き刺す。
- からストローを削除します。ホルダーとラベルの付いたゴブレに転送する。
- 最後に、液体窒素タンク内のゴブレを格納する。
IV。プロトコルを解凍
- 液体窒素タンクからストローを削除します。
- 40秒間室温でわらを維持する。
- 40秒間に30℃の水浴中でわらを浸す。
- わらからプラグを外したり、熱シールドチップをカット。
- 35mmのペトリ皿の中でわらを空にし、軽く凍結と融解のソリューションを含む2滴を混ぜる。
- 室温で15分間、混合物中の卵母細胞/胚のままにしておきます。
- 37℃でさらに15分間KSOM - Hの新鮮なドロップ℃に卵母細胞/胚を転送する
- 卵母細胞/胚は、現在、さらに操作のための準備が整いました。
注：手順6と7の間は、融解した卵母細胞/胚は徐々に水分補給のために、最大膨潤ているはずです。
V.代表の結果
凍結保存プロトコルを使用すると、ここにハムスターの卵母細胞のための約95％のそれぞれ> 90％、前核、2セルと4セルの段階で85％とマウスB6CBAF1胚は80％、の生存率の結果を報告した。マウスの胚を解凍後KSOMにin vitroで培養すると、少なくとも70〜80％の最適な培養条件で胚盤胞期に到達する必要があります。
それはあなたがそれぞれの凍結実験で、卵母細胞/胚の残りの部分はさらなる操作のために使用される前に、このグループを解凍その卵母細胞/胚の対照群（わら）を含めることをお勧めします。対照群の生存率が予想よりも低い場合、同一ロットから別のわらを解凍。この2番目のグループの生存率も低い場合、この凍結ロットから残りのストローを破棄。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでハムスターの卵母細胞およびマウス胚は、正常に凍結保存することができます。一度凍結、卵母細胞/胚が無期限に液体窒素タンクに貯蔵し、必要に応じて任意の時間または場所で回収することができます。これにより、必要なときに使用する準備がほぼ試料を有するという利点を提供しています。一方、このプロトコルはまた、生きた動物のコロニーの維持に経済的かつ安全な代替として貴重なマウス系統（そのようなトランスジェニック線など）、から胚cryobanksを生成するために使用することができます。このプロトコルは、ハムスターの卵母細胞およびハイブリッドB6CBAF1マウスの胚を凍結保存するために最適化されていることに注意することは重要です。異なる遺伝的背景を持つマウスの胚の中で解凍後の生存率がこのように注意が卵母細胞/胚のそれぞれの種または系統の凍結保存の条件を評価し、卵母細胞の発生前に適切なプロトコルを確立するために取られるべきである、8,9を記載されているに違いまたは胚cryobanks。
ハムスターの卵母細胞は、精子の侵入テストのためや精子の染色体分析10の、または細胞質内精子注入法（ICSI）で初心者のための材料を練習するなど、人間の生殖補助診療所で使用することができます。一方、前核または2セルの段階で、マウスハイブリッドB6CBAF1胚は、胚の培養培地やインキュベーターの適切な機能の品質をチェックするために人間の生殖補助センターまたは研究室で使用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、スペイン語MinisterioデEducación Y Ciencia（BIO 2006から11792）とのGeneralitat de Catalunyaの（2005 - SGR00437）によってサポートされていました。著者は、メディアを準備する彼らの技術支援のためのMarc Puigcerverとジョナタンルーカスに感謝します。 ServeiドールEstabulariからすべてのスタッフは動物の住宅、そしてこのビデオの一部を記録する上での追加の貢献のために特にフアンホセマーティンとハビエルニートのために認められている。 NCBは、 ポルトガル語Fundaçãoパラの仲間Ciência電子TecnologiaとSGはスペイン語MinisterioデEducación Y Cienciaの仲間です。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
