Summary
В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.
Abstract
Эмбрионы и ооцитов были впервые успешно криоконсервированных более 30 лет назад, когда Уиттингем
Protocol
Ухода за животными и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, утвержденными Комитетом по этике на человека и животных Исследование Universitat Автономного Барселоны, Испания.
И. ооцитов коллекции
- Проверить и выбрать женский хомяков (Mesocricetus рыбки; 8-12 недели назад) Золотой сирийской напряжение на наличие толстого выделения из влагалища (постовуляторной разряд).
- Вызвать выбранных самок superovulate путем внутрибрюшинного введения 40 МЕ PMSG (Беременные Маре Сыворотка гонадотропин), затем 40 МЕ ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) 60 часов спустя.
- Эвтаназии женщины хомяков 16 часов после введения ХГЧ в камеру углекислого газа.
- Изолировать от яйцеводы женщины, как показано на видео и передавать их на каплю KSOM-H среды.
- Сбор ооцит-кучевые комплексов, оторвав яйцевода ампула под стереоскопическим микроскопом в капле гиалуронидазы (156 ед / мл) при 37 ° C. Ооциты будет освобожден от клеток кумулюса примерно в 5 минут.
- Возьмите ооцитов от гиалуронидазы и мыть их дважды в KSOM-H среды.
Для сбора эмбрионов мыши, самки мышей (Mus мышцы; 6-8 недели назад) индуцируются на superovulate путем внутрибрюшинного введения 5 МЕ PMSG затем 5 МЕ ХГЧ 48 часов спустя, и совокуплялись с самцов мышей. Женщины жертвуют цервикальным сдвигом на 24-26, 44-46 или 54-56 часов после введения ХГЧ для obtention из пронуклеусов, 2-клетки или 4-элементный эмбрионов этапе, соответственно. Сборник пронуклеусов эмбрионов выполняется точно так, как описано для хомяка ооцитов. Эмбрионы на 2-клеток и 4-элементным этапах собираются промывки яйцеводы с KSOM-H среды [6].
Примечание: В соответствии с этим протоколом примерно от 20 до 30 яйцеклеток / эмбрионов могут быть собраны с каждой женщиной.
II. Подготовка замораживания и оттаивания решения
- Подготовка решение, которое я разбавлением 0,57 мл propilenglycol в 5 мл KSOM-H (1,5 М propilenglycol).
- Подготовка оттаивания решение, добавив 2 мл KSOM-H для трубы с 0,2052 г сахарозы (0,3 М сахарозы).
- Подготовка замораживания решение, добавив 2 мл раствора я в трубку с 0,0684 г сахарозы (1,5 М propilenglycol и 0,1 М сахарозы).
Примечание: Я решение и замораживания и оттаивания решения должны быть подготовлены как раз перед их использованием. Тем не менее, указанное количество сахарозы, которые будут использоваться для подготовки замораживания и оттаивания решения могут быть взвешены заранее и хранить в 3 мл трубки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
III. Замораживание протоколов
- Передача ооцитов / эмбрионов из KSOM-H средних каплю раствора я и инкубировать в течение 7-15 минут при комнатной температуре.
- Между тем, подготовить 90 мм чашки Петри для загрузки соломкой, разместив 90 мкл капли замораживания и оттаивания решения, как это показано на видео (1 капля каждого решения / соломы).
- Передача необходимое количество яйцеклеток / эмбрионов для замораживания капель раствора.
Примечание: Мы обычно передачи от 5 до 30 яйцеклеток или эмбрионов / вывода. - Прикрепить соломенного до устья управляемой системы аспирации и загрузить его следующим таком порядке: решение, которое я, воздуха, замерзания капли с ооцитов, воздух, таяние капли, воздух.
- После соломы загружена, сохранить аспирационных до первой капли введен (раствор I) достигает полимера на верхнем конце соломы и тюленей в этом направлении. Термо-печать другом конце соломы или печать с пластиковой заглушкой.
- Включите программируемых морозильник и выберите замораживании программы. Замораживание программы, используемые в настоящем протоколе основан на скоростях охлаждения первоначально опубликовано Лассаля и др.. [7]:
- 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C
0 ° С / мин в течение 10 мин, чтобы обеспечить равновесие температуры и индукции посева (см. ниже) - 0,3 ° С / мин от -7 ° C до -30 ° С
0 ° С / мин в течение 2 мин, чтобы обеспечить температуру равновесия - 35 ° С / мин от -30 ° С до -130 ° С
- 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C
- Нагрузка на соломинки слотов владельца программируемых морозильник, убедившись, что часть соломы с каплей оттаивания решение наружу. Начать замораживание программы.
- Когда температура образца достигает -7 ° С и охлаждение на удержание, произвести ручную посева: окунуться щипцов в жидкий азот, потяните держатели немного не в морозильник, чтобы выставить часть соломинки содержащие капли оттаивания решение, и сразу же коснуться этой части соломинки с щипцами. Повторите эти действия для каждого держателя, и каждый соломы в держатель, а затем пусть замораживание программы продлится до конца.
- Когда программа завершится, окунуться держателей в жидком азоте.
- Удалить из соломкивладельцы и передавать их на помечены gobelet.
- Наконец, хранить gobelet внутри резервуар жидкого азота.
IV. Размораживание протокола
- Удалить из соломы резервуар жидкого азота.
- Поддерживать соломы при комнатной температуре в течение 40 секунд.
- Замочите соломы на водяной бане при температуре 30 ° С в течение 40 секунд.
- Удалить вилку из соломы или вырезать термо-запечатанном чаевые.
- Пустые соломы в 35-мм чашки Петри и хорошо смешайте две капли, содержащие замораживания и оттаивания решений.
- Оставьте ооцитов / эмбрионов в смеси в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Передача ооцитов / эмбрионов свежие капли KSOM-H для еще 15 минут при 37 ° C.
- Ооцитов / эмбрионов теперь готовы для дальнейшей манипуляции.
Примечание: Во время действия 6 и 7 вы увидите, что талые яйцеклеток / эмбрионов медленно раздуваются за счет регидратации.
Результаты В. представитель
Использование протокола криоконсервации сообщили здесь результаты в выживаемости примерно 95% для хомяка ооцитов и> 90%, 85% и 80% для мыши B6CBAF1 эмбрионов на пронуклеусов, 2-клеток и 4-элементным этапах соответственно. Когда мышь эмбрионы культивировали в пробирке в KSOM после оттаивания, по крайней мере от 70 до 80% должна достичь стадии бластоцисты в оптимальных условиях культуры.
Рекомендуется, чтобы вы включили контрольной группе (соломы) ооцитов / эмбрионов в каждом замораживания эксперимент, и что вы оттепель эту группу раньше остальных яйцеклеток / эмбрионов используются для дальнейших манипуляций. Если выживаемость в контрольной группе ниже, чем ожидалось, оттепель другой соломы от той же партии. Если выживаемость для этой второй группы также низко, отбросить оставшиеся соломинки из этого замораживания много.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью этого протокола хомяка ооцитов и эмбрионов мыши могут быть успешно криоконсервированных. Как только замороженные, ооциты / эмбрионы могут храниться в жидком азоте танки на неопределенный срок и восстановления в любое время или место лучшего. Это дает преимущество, что образцы почти готова к использованию, когда это необходимо. С другой стороны, этот протокол также может быть использован для создания эмбриона криобанков из ценных линий мышей (например, трансгенные линии), а экономические и безопасной альтернативой для поддержания живых колоний животных. Важно отметить, что данный протокол оптимизирован для cryopreserve хомяка ооцитов и гибридных эмбрионов B6CBAF1 мыши. Различия в пост-оттаивания выживаемость среди эмбрионов мыши с различными генетическими фоны были описаны 8,9, при этом следует позаботиться, чтобы оценивать криоконсервации условиях на каждый вид или штамм ооцитов / эмбрионов и установить соответствующий протокол до поколение ооцитов или криобанков эмбриона.
Хомяк ооцитов могут быть использованы в человеческой помощи клиник репродукции для теста проникновения спермы или сперму для анализа хромосом 10, или, как практикующие материал для новичков в интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). С другой стороны, мышь гибридных эмбрионов на B6CBAF1 пронуклеусов или 2-клетка этапы могут быть использованы в человеческой помощи центров размножения или в исследовательских лабораториях, чтобы проверить качество эмбрионов культуры средств массовой информации или надлежащего функционирования инкубаторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана испанский Ministerio де Educación у Ciencia (BIO 2006-11792) и Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Puigcerver и Джонатан Лукас за техническую помощь в подготовке информации. Все сотрудники Servei d'Estabulari признается для содержания животных, и особенно Хуан Хосе Мартин и Хавьера Бенито для их дополнительного взноса на запись часть этого видео. НЦБ является членом португальской Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia и SG является членом испанской Ministerio де Educación у Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
