Summary
En este video-artículo se presenta una demostración paso a paso sobre cómo recoger y criopreservar óvulos de hámster con altas tasas de supervivencia después de la descongelación. El mismo procedimiento se puede aplicar para congelar y descongelar con éxito embriones de ratón en las diferentes etapas de desarrollo de preimplantación.
Abstract
Embriones y ovocitos criopreservados fueron los primeros con éxito más de 30 años, cuando Whittingham
Protocol
Cuidado de los animales y los procedimientos se realizaron de acuerdo a los lineamientos y reglamentos aprobados por el Comité de Ética en la investigación animal y humana de la Universitat Autònoma de Barcelona, España.
I. recolección de ovocitos
- Comprobar y seleccionar hamsters hembra (Mesocricetus auratus, 8-12 semanas de edad) de la cepa de oro de Siria a la presencia de una secreción espesa vaginal (flujo postovulatoria).
- Inducir a las mujeres seleccionadas para superovular por inyección intraperitoneal de 40 UI de PMSG (gonadotropina sérica de yegua gestante), seguido de 40 UI de hCG (gonadotropina coriónica humana) 60 horas después.
- Eutanasia hamsters mujer de 16 horas tras la administración de hCG en una cámara de dióxido de carbono.
- Aislar a los oviductos de las hembras, como se muestra en el video y transferirlos a una gota de KSOM-H medio.
- Recoger cúmulos ovocito complejos por romper la ampolla del oviducto bajo un microscopio estereoscópico en una gota de hialuronidasa (156 U / ml) a 37 ° C. Los ovocitos se libera de células del cumulus en aproximadamente 5 minutos.
- Recoger óvulos de hialuronidasa y lavar dos veces en KSOM-H medio.
Para la recogida de embriones de ratones, los ratones hembra (Mus musculus; 6-8 semanas de edad) son inducidos a superovular por inyección intraperitoneal de 5 UI de PMSG seguido de 5 UI de hCG 48 horas más tarde y se aparearon con ratones machos. Las hembras son sacrificadas por dislocación cervical en el 24-26, 44-46 o 54-56 horas después de la administración de hCG para la obtención de pronuclear, de 2 o 4 células de células de embriones etapa, respectivamente. Recolección de los embriones pronuclear se lleva a cabo exactamente como se describe en ovocitos de hámster. Embriones en las fases 2-célula y célula-4 son recogidos por el lavado del oviducto con KSOM-H medio [6].
Nota: Después de este protocolo de aproximadamente 20 a 30 ovocitos / embriones se pueden recoger de cada mujer.
II. Preparación de congelación y descongelación de soluciones
- Prepare una solución de I diluyendo 0,57 ml de propilenglicol en 5 ml de KSOM-H (1,5 M de propilenglicol).
- Prepare una solución de descongelación mediante la adición de 2 ml de KSOM-H a un tubo con 0,2052 g de sacarosa (0,3 M de sacarosa).
- Preparar la solución de congelación mediante la adición de 2 ml de solución que a un tubo con 0,0684 g de sacarosa (1,5 M de propilenglicol y 0,1 M de sacarosa).
Nota: la solución y la congelación y descongelación, y deben prepararse justo antes de su uso. Sin embargo, las cantidades especificadas de la sacarosa que se utilizará para la preparación de la congelación y descongelación de soluciones puede ser ponderada por adelantado y almacenado en tubos de 3 ml a temperatura ambiente durante varios meses.
III. Protocolo de congelación
- Transferencia de ovocitos / embriones del medio KSOM-H a una gota de la solución I y se incuba durante 7-15 minutos a temperatura ambiente.
- Mientras tanto, prepare una placa de Petri de 90 mm para cargar la paja mediante la colocación de l 90 gotas de congelación y descongelación de soluciones como se muestra en el video (1 gota de cada solución / paja).
- Transferir la cantidad deseada de los ovocitos / embriones de las gotas de solución de congelación.
Nota: Por lo general, la transferencia de entre 5 y 30 ovocitos o embriones / drop. - Adjunte una paja a un sistema de aspiración controlada y la boca de carga es el siguiente orden: solución que yo, el aire, la caída de la congelación de los ovocitos, el aire, la caída de la descongelación, el aire.
- Una vez que la paja se ha cargado, mantener la aspiración hasta que la gota introdujo por primera vez (solución I) alcanza el polímero en el extremo superior de la paja y las juntas este fin. Termo-sellar el otro extremo de la paja o el sello con un tapón de plástico.
- Encienda el congelador programable y seleccione el programa de congelación. El programa de congelación utilizado en este protocolo se basa en la velocidad de enfriamiento, publicada originalmente por Lassalle et al. [7]:
- 2 ° C / min desde la temperatura ambiente a -7 ° C
0 ° C / min durante 10 minutos para permitir el equilibrio de temperatura y la inducción de la siembra (ver más abajo) - 0,3 ° C / min de -7 ° C a -30 ° C
0 ° C / min durante 2 minutos para permitir el equilibrio de temperatura - 35 ° C / min desde -30 ° C a -130 ° C
- 2 ° C / min desde la temperatura ambiente a -7 ° C
- La carga de la paja en las ranuras de la titular de la nevera programable, asegurándose de que la parte de la paja con la gota de solución de descongelación es hacia el exterior. Iniciar el programa de congelación.
- Cuando la temperatura de la muestra llega a -7 ° C y el enfriamiento está en espera, lleve a cabo la siembra manual: hundir el fórceps en nitrógeno líquido, tire de los titulares de un poco fuera del congelador para exponer la parte de las pajillas que contienen las gotas de la solución de descongelación, y de inmediato tocar esta parte de la paja con las pinzas. Repita este procedimiento para cada titular y la paja en el soporte de cada uno, y luego dejar que el programa de congelación hasta el final.
- Cuando el programa se ha completado, los titulares de la caída en nitrógeno líquido.
- Quitar la paja deltitulares y transferirlos a un gobelet etiquetados.
- Finalmente, coloque la gobelet dentro de un tanque de nitrógeno líquido.
IV. Descongelación protocolo
- Quitar la paja del tanque de nitrógeno líquido.
- Mantener la paja a temperatura ambiente durante 40 segundos.
- Remoje la paja en un baño de agua a 30 ° C durante 40 segundos.
- Retire el tapón de la paja o cortar la punta de la termo-selladas.
- Vaciar la paja en un plato de petri de 35 mm y mezcle suavemente las dos gotas que contienen el congelamiento y descongelamiento soluciones.
- Deja los ovocitos / embriones en la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- La transferencia de ovocitos / embriones a una caída fresca de KSOM-H por 15 minutos a 37 ° C.
- Los ovocitos / embriones están listos para su posterior manipulación.
Nota: En los pasos 6 y 7 que usted debe ver que los ovocitos descongelados / embriones poco a poco se hinchan debido a la rehidratación.
V. Los resultados representativos
El uso del protocolo de criopreservación que aquí resulta en una tasa de supervivencia de aproximadamente el 95% de los ovocitos de hámster y de> 90%, 85% y 80% para el ratón B6CBAF1 embriones en el pronuclear, dos etapas de las células y de 4 celdas, respectivamente. Cuando los embriones de ratón se cultivaron in vitro en KSOM después de la descongelación, por lo menos 70 a 80% debería llegar a la etapa de blastocisto, en condiciones óptimas de cultivo.
Se recomienda que se incluye un grupo de control (paja) de los ovocitos / embriones en cada experimento de congelación y deshielo que este grupo antes que el resto de los ovocitos / embriones se usan para otras manipulaciones. Si las tasas de supervivencia para el grupo control son inferiores a lo esperado, descongelar otra paja del mismo lote. Si las tasas de supervivencia de este segundo grupo son también bajas, desechar la paja que queda de este lote de congelación.
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Discussion
Con este protocolo de ovocitos de hámster y de embriones de ratón pueden ser criopreservados con éxito. Una vez congelado, los ovocitos / embriones pueden ser almacenados en tanques de nitrógeno líquido por tiempo indefinido y se recuperó en cualquier momento o lugar deseado. Esto ofrece la ventaja de tener muestras de casi listo para su uso cuando sea necesario. Por otro lado, este protocolo también se puede utilizar para generar criobancos embrión a partir de cepas de ratón de gran valor (como las líneas de transgénicos), como una alternativa económica y segura para el mantenimiento de colonias de animales vivos. Es importante señalar que este protocolo se ha optimizado para criopreservar óvulos de hámster y de híbridos de embriones de ratón B6CBAF1. Las diferencias en las tasas de supervivencia después de la descongelación de los embriones de ratones con diferentes bases genéticas se han descrito 8,9, por lo tanto se debe tener cuidado al evaluar las condiciones de la criopreservación sobre cada especie o variedad de los ovocitos / embriones y establecer el protocolo adecuado antes de la generación de ovocitos o criobancos embrión.
Ovocitos de hámster se puede utilizar en humanos clínicas de reproducción asistida para la prueba de penetración de los espermatozoides o de análisis de esperma cromosoma 10, o como se entrena un material para los principiantes en la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Por otro lado, un ratón híbrido B6CBAF1 embriones en etapas pronuclear o dos células se pueden utilizar en humanos los centros de reproducción asistida o en laboratorios de investigación para comprobar la calidad de los medios de cultivo de embriones o el buen funcionamiento de las incubadoras.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio español de Educación y Ciencia (BIO 2006 hasta 11.792) y la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Los autores desean agradecer a Marc Puigcerver y Lucas Jonatan por su asistencia técnica en la preparación de los medios de comunicación. Todo el personal de la Estabulari Servei d'es reconocido por albergar a los animales y, especialmente, Juan José Martín y Javier Benito, por su contribución adicional sobre la grabación de parte de este video. BCN es un miembro de la Fundación un párrafo portugués Ciência e Tecnologia y SG es un compañero de la española Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
