Summary
Bu video-makale-çözülme sonrası sağkalım oranları yüksek bir hamster oosit toplamak ve cryopreserve nasıl bir adım-adım gösteri sunuyoruz. Aynı işlem, başarılı bir şekilde dondurma ve preimplantasyon gelişimi farklı aşamalarında fare embriyoları Çözülme uygulanabilir.
Abstract
Zaman Whittingham Embriyolar ve oositlerin ilk başarıyla, 30 yıldan daha uzun önce Kriyoprezerve edildi
Protocol
Hayvan bakım ve prosedürleri, Barselona, İspanya Universitat Autonoma Hayvan ve İnsan Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış kurallar ve düzenlemelere göre yapılmıştır.
I. Oosit toplama
- Altın Suriye suşu kalın bir vajinal akıntı (postovulatory akıntı) varlığı için; dişi hamster (8-12 hafta eski Mesocricetus auratus) kontrol edin ve seçin.
- 60 saat sonra intraperitoneal (Gebe Kısrak Serum gonadotropin) hCG (insan koryonik gonadotropin) 40 IU 40 IU PMSG superovulate için seçilen kadın neden.
- Karbon dioksit odası hCG uygulanmasından 16 saat sonra dişi hamster Euthanize.
- Siyon hatası videoda gösterildiği gibi kadın izole etmek ve KSOM-H orta bir damla aktarabilirsiniz.
- 37 hiyalüronidaz (156 U / ml), bir damla stereoskopik mikroskop altında yumurtalık ampulla yırtarak oosit-kümülüs kompleksleri toplayın ° C. Oosit kümülüs hücreleri yaklaşık 5 dakika içinde serbest olacak.
- Hiyalüronidaz gelen oosit pick up ve KSOM-H orta ve iki kez yıkayın.
Fare embriyo toplanması için, dişi farelerde (Mus musculus; 6-8 hafta eski) daha sonra 5 IU hCG 48 saat takip ve erkek fareler ile evlendirilen PMSG 5 IU intraperitoneal superovulate indüklenen. Dişiler 24-26 servikal dislokasyon ile sakrifiye pronükleer, 2-hücre veya 4-hücreli aşamada embriyoların sırasıyla obtention hCG uygulandıktan sonra 44-46 veya 54-56 saat. Pronükleer embriyoların toplanması tam bir hamster oosit açıklandığı gibi yapılır. 2-hücre ve 4-hücreli aşamada Embriyolar KSOM-H orta [6] siyon hatası kızarma toplanır.
Not: Bu protokol sonrasında yaklaşık olarak 20 ila 30 oosit / embriyoların her kadın alınacak .
II. Dondurma ve çözme çözümler hazırlanması
- Propilenglycol KSOM-H (propilenglycol 1.5 M) 5 ml, 0.57 ml seyreltilmesiyle çözüm hazırlayın.
- 0,2052 g sakkaroz (sakkaroz 0.3 M) ile bir tüp KSOM-H 2 ml ekleyerek çözülme çözüm hazırlayın.
- 0,0684 g sakaroz (1.5 propilenglycol M ve 0.1 M sakkaroz) ile bir tüp çözümü ben 2 ml ekleyerek donma çözüm hazırlayın.
Not: Çözüm I ve çözümler dondurma ve çözme sadece kendi kullanmadan önce hazır olmalıdır. Ancak, donma ve çözülme çözümler hazırlanması için kullanılacak sakaroz belirtilen miktarlarda avans ağırlıklı ve birkaç ay için 3 ml tüpler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
III. Donma protokol
- Transfer oosit / KSOM-H orta çözümü ben bir damla ve 7-15 dakika oda sıcaklığında inkübe embriyolar.
- Bu arada, 90 video (1 damla her çözüm / saman) görüldüğü gibi, dondurma ve çözme çözümler ul damla koyarak payet yüklemek için 90 mm petri hazırlar.
- İstenilen sayıda oosit / embriyo dondurma çözüm damla aktarın.
Not: Biz genellikle 5 ila 30 oosit veya embriyo / bırak arasında transfer. - Ağız kontrollü aspirasyon sistemi bir saman takın ve bu sırada aşağıdaki yükü: çözümü, hava, oosit, hava, çözülme damla, hava ile dondurma bırak.
- Saman yüklendikten sonra, saman ve mühürler Bu amaçla en sonunda polimer ulaşan ilk damla (çözüm) tanıtıldı kadar aspire tutun. Termo-plastik bir fiş ile saman veya mühür mühür diğer ucunu.
- Programlanabilir dondurucu açın ve donma programı seçin. Bu protokolde kullanılan dondurma programı, Lassalle ve arkadaşları tarafından yayınlanan soğutma hızları dayanır. [7]:
- -7 Oda sıcaklığında 2 ° C / dak ° C
0 ° C / dk 10 dk tohum sıcaklık dengeleme ve indüksiyon için izin (aşağıya bakın) - -7 'Den 0,3 ° C / dak ° C ila -30 ° C
0 ° C / dk 2 dk sıcaklık dengelenmesi için izin - 35 ° C / dak -30 ° C -130 ° C
- -7 Oda sıcaklığında 2 ° C / dak ° C
- Çözülme çözüm damla ile saman parçası dışa karşı karşıya olduğunu emin olun, programlanabilir dondurucu sahibinin yuvaları payet yükleyin. Donma programını başlatın.
- Örnek sıcaklığı -7 ° C ve soğutma beklemeye ulaştığında, elle tohumlama gerçekleştirin: sıvı azot içine atılmak forseps, hemen çözüm çözülme damla içeren payet bölümünü ortaya çıkarmak için, hafifçe dışarı dondurucu sahiplerine doğru çekin ve forseps ile payet bu dokunun. Sahibinin her tutucu ve her saman için tekrarlayın ve sonra donma program sonuna kadar işletilen sağlar.
- Program tamamlandığında, sıvı nitrojen içinde sahiplerine dalıyoruz.
- Payet Kaldıretiketli gobelet sahipleri ve aktarabilirsiniz.
- Son olarak, bir sıvı nitrojen tankı içinde gobelet saklayın.
IV. Protokol Çözülme
- Sıvı nitrojen tankı saman çıkarın.
- 40 saniye boyunca oda sıcaklığında saman koruyun.
- 40 saniye boyunca 30 ° C'de su banyosunda saman bekletin.
- Saman fişi çıkarın veya termo-mühürlü ucu kesmek.
- 35 mm petri saman boşaltın ve hafifçe donma ve çözülme çözümler içeren iki damla karıştırın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karışımı oosit / embriyoların bırakın.
- 37 KSOM-H taze bir damla ilave bir 15 dakika için oosit / embriyo transferine ° C
- Oosit / embriyoların şimdi manipülasyon için hazır.
Not: 6. ve 7. adımları sırasında çözülmüş oosit / embriyoların yavaş rehidrasyon için nedeniyle şişer göreceksiniz.
V. Temsilcisi Sonuçlar
Kriyoprezervasyon protokol burada bir hamster oosit için yaklaşık% 95 ve>% 90,% 85 ve fare B6CBAF1 embriyolar pronükleer, 2-hücre ve 4-hücreli aşamaları sırasıyla% 80, sağ kalım oranı sonuçlar bildirdi. Fare embriyoları çözme sonrası KSOM in vitro kültür, en az 70 ila% 80, en iyi kültür koşullarında blastosist aşamasına ulaşması gerekir.
(Saman) ve oosit / embriyo dondurma her deneyde bir kontrol grubu yer almasını tavsiye ederiz oosit / embriyo geri kalanında daha fazla manipülasyonları için kullanılan önce bu grup Çözülme. Kontrol grubunda sağkalım oranları beklenenden daha düşük ise, aynı partinin diğerine saman Çözülme. Bu ikinci grup için sağkalım oranları da düşük ise, bu dondurma çok kalan payet atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bir hamster oosit ve fare embriyoları ile başarıyla Kriyoprezerve olabilir. Bir kez dondurulmuş, oosit / embriyoların sıvı nitrojen tanklarında süresiz saklanır ve istenilen herhangi bir yerde veya zamanda telafi edilebilir. Bu ihtiyaç duyulduğunda kullanmak örneklerin neredeyse hazır sahip olmanın avantajını sunar. Öte yandan, bu protokol de, canlı hayvan kolonileri bakımı, ekonomik ve güvenli bir alternatif olarak değerli fare suşları (transgenik hatları gibi), embriyo cryobanks oluşturmak için kullanılır. Bu protokol bir hamster oosit ve melez B6CBAF1 fare embriyoları cryopreserve optimize olduğunu not etmek önemlidir. -Çözülme sonrası sağkalım oranları farklı genetik geçmişleri olan fare embriyoları arasında farklılıklar dolayısıyla bakım, her tür veya oosit / embriyo gerginlik dondurulması koşulları değerlendirmek ve oosit nesil önce uygun protokol kurmak için alınmalıdır, 8,9 tarif edilmiştir veya embriyo cryobanks.
Hamster oosit sperm penetrasyon testi için ya da sperm kromozom analizi 10 ya da malzeme intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yeni başlayanlar için pratik olarak insan yardımlı üreme kliniklerinde kullanılabilir . Öte yandan, fare B6CBAF1 hibrid embriyolar pronükleer veya 2-hücreli aşamada embriyo kültür ortamları veya kuluçka düzgün işleyişini kalitesini kontrol etmek için insan Yardımla üreme merkezleri ya da araştırma laboratuvarlarında kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, İspanyol Ministerio de educacion y Ciencia (BIO 2.006-11.792) ve Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) tarafından desteklenmiştir . Yazarlar medya hazırlanmasında Marc Puigcerver ve Jonatan Lucas kendi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Servei d'Estabulari tüm personeli, hayvan barınağı için kabul ve özellikle bu video kayıt ek katkı Juan Jose Martin ve Javier Benito. NCB Ciencia e Tecnologia ve SG, Portekizce Fundação para İspanyolca Ministerio de educacion y Ciencia bir adam bir adam .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
