Summary
I denna video-artikeln presenterar vi en steg-för-steg demonstration om hur man samlar och cryopreserve hamster oocyter med hög post-tina överlevnad. Samma förfarande kan också tillämpas för att lyckas frysa och tina musembryon i olika skeden av preimplantatorisk utveckling.
Abstract
Embryon och ägg var först framgångsrikt frysförvarade mer än 30 år sedan, när Whittingham
Protocol
Djuromsorg och förfaranden genomfördes enligt de riktlinjer och regler som godkänts av den etiska kommittén för djurs och människors forskning i Universitat Autònoma av Barcelona, Spanien.
I. Oocyte samlingen
- Kontrollera och välj kvinnliga hamstrar (Mesocricetus auratus, 8-12 veckor gamla) i den gyllene syriska stam för förekomst av en tjock flytningar (postovulatory urladdning).
- Förmå utvalda kvinnor att superovulate efter intraperitoneal injektion av 40 IE PMSG (gravida Mare serum gonadotropin) följt av 40 IE hCG (humant koriongonadotropin) 60 timmar senare.
- Euthanize kvinnliga hamstrar 16 timmar efter administrering av hCG i en koldioxid kammare.
- Isolera äggledarna från honor som visas i videon och överföra dem till en droppe KSOM-H medium.
- Samla äggcellen-cumulus komplex genom att riva den äggledare ampulla under ett stereoskopiska mikroskop i en droppe hyaluronidas (156 U / ml) vid 37 ° C. Oocyter kommer att befrias från cumulus celler i cirka 5 minuter.
- Plocka upp ägg från hyaluronidas och tvätta dem två gånger i KSOM-H medium.
Vid insamling av musembryon, honmöss (Mus musculus, 6-8 veckor gamla) är förmås att superovulate genom intraperitoneal injektion av 5 IE PMSG följt av 5 IE hCG 48 timmar senare och parat sig med hanmöss. Honorna offras av halsdislokation på 24-26, 44-46 eller 54-56 timmar efter administrering av hCG för uppnår ratingen pronuclear, 2-cell eller 4-cells embryon skede, respektive. Insamling av pronuclear embryon utförs precis som på hamster oocyter. Embryon i 2-cell och 4-cells steg samlas in genom att spola på äggledarna med KSOM-H medel [6].
Obs: Efter detta protokoll ca 20 till 30 oocyter / embryon kan samlas in från varje hona.
II. Beredning av frysning och upptining lösningar
- Bered jag genom utspädning 0,57 ml propilenglycol i 5 ml KSOM-H (1,5 M av propilenglycol).
- Förbered upptining lösning genom att tillsätta 2 ml KSOM-H för att ett rör med 0,2052 g sackaros (0,3 M sackaros).
- Förbered frysning lösning genom att tillsätta 2 ml lösning jag ett rör med 0,0684 g sackaros (1,5 M i propilenglycol och 0,1 M sackaros).
OBS: Lösning I och nedfrysning och upptining lösningar måste beredas strax före användning. Däremot kan de angivna beloppen av sackaros som ska användas för beredning av frysning och upptining lösningar vägas i förväg och förvaras i 3 ml-rör i rumstemperatur i flera månader.
III. Frysning protokoll
- Överföring oocyter / embryon från KSOM-H medellång till en droppe av lösning I och inkubera i 7-15 minuter vid rumstemperatur.
- Under tiden förbereder en 90 mm petriskål att ladda sugrör genom att placera 90 l droppar nedfrysning och upptining lösningar som den visas i videon (1 droppe av varje lösning / halm).
- Överför det önskade antalet oocyter / embryon från frysning lösningen droppar.
Observera: Vi brukar transfer mellan 5 och 30 äggceller eller embryon / droppe. - Fäst ett halmstrå i en mun kontrollerat utsugningssystem och ladda den efter följande ordning: lösningen jag, luft, frysning droppe med ägg, luft, upptining droppe, luft.
- När halmen är laddad, hålla aspirerande tills den första droppen infördes (lösning I) når polymeren vid den övre änden av halm och sälar detta ändamål. Thermo-försegla andra änden av halm eller tätning med en plastplugg.
- Slå på programmerbara frysen och välj frysning programmet. Frysning program som används i detta protokoll är baserad på avkylning ursprungligen publicerad av Lassalle et al. [7]:
- 2 ° C / min från rumstemperatur till -7 ° C
0 ° C / min i 10 min för att möjliggöra för temperatur jämvikt och induktion av sådd (se nedan) - 0,3 ° C / min från -7 ° C till -30 ° C
0 ° C / min för 2 min för att möjliggöra för temperatur jämvikt - 35 ° C / min från -30 ° C till -130 ° C
- 2 ° C / min från rumstemperatur till -7 ° C
- Ladda strån på spåren av innehavaren av den programmerbara frysen och se till att den del av halmen med droppe upptining lösning är vänd utåt. Starta frysning programmet.
- När provtagningen temperaturen når -7 ° C och kyla på is, utföra manuell sådd: störta pincetten i flytande kväve, dra innehavarna något ur frysen att exponera en del av strån som innehåller droppar upptining lösning, och omedelbart Rör denna del av strån med pincett. Upprepa för varje innehavare och varje halm i hållaren, och sedan låta den frysning programmet löper fram till slutet.
- När programmet är klar, ta ett dopp innehavarna i flytande kväve.
- Ta bort strån fråninnehavare och överföra dem till en märkt gobelet.
- Slutligen, förvara gobelet inuti en flytande kväve tank.
IV. Upptining av protokoll
- Ta bort halmen från flytande kväve tanken.
- Behåll halmen vid rumstemperatur i 40 sekunder.
- Blötlägg halmen i ett vattenbad vid 30 ° C under 40 sekunder.
- Ta bort pluggen ur halm eller klippa termo-förseglade spetsen.
- Töm strået i en 35-mm petriskål och försiktigt blanda två droppar innehåller frysning och upptining lösningar.
- Lämna oocyter / embryon i blandningen i 15 minuter i rumstemperatur.
- Överföring oocyter / embryon till en ny droppe KSOM-H för ytterligare 15 minuter vid 37 ° C.
- Oocyter / embryon är nu redo för ytterligare manipulation.
Observera: Under steg 6 och 7 bör du se till att tinade oocyter / embryon som sakta sväller upp på grund av rehydrering.
V. representativa resultat
Användningen av frysförvaring protokollet redovisas här resulterar i en överlevnad på cirka 95% för hamster oocyter och> 90%, 85% och 80% för mus B6CBAF1 embryon vid pronuclear, 2-cell och 4-cells steg, respektive. När musembryon odlas in vitro i KSOM efter upptining bör minst 70 till 80% nå blastocyststadiet i optimal odlingsbetingelser.
Det rekommenderas att du tar med en kontrollgrupp (halm) av oocyter / embryon i varje frysning experiment och att du tina denna grupp innan resten av oocyter / embryon som används för ytterligare manipulationer. Om överlevnaden för kontrollgruppen är lägre än väntat, tina annan halm från samma parti. Om överlevnaden för denna andra grupp är också låg, kasta den överblivna strån från denna frysning mycket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med detta protokoll hamster oocyter och embryon mus kan framgångsrikt frysförvarade. När frysta, kan oocyter / embryon förvaras i flytande kväve tankar på obestämd tid och vid någon tidpunkt återvinnas eller önskad plats. Detta ger fördelen av att ha prov nästan färdig att använda när det behövs. Å andra sidan kan detta protokoll också användas för att generera embryo cryobanks från värdefulla musstammar (t.ex. transgena linjer), som ett ekonomiskt och säkrare alternativ för upprätthållandet av levande djur kolonier. Det är viktigt att notera att detta protokoll är optimerad för att cryopreserve hamster äggceller och hybrid B6CBAF1 embryon mus. Skillnader i post-tina Överlevnaden bland musembryon med olika genetisk bakgrund har beskrivits 8,9, så försiktighet bör vidtas för att bedöma frysförvaring villkor för varje art eller stam oocyter / embryon och att fastställa lämpliga protokollet före generationen av äggcellen eller embryo cryobanks.
Hamster oocyter kan användas i människans assisterad befruktning kliniker för spermierna penetration test eller för spermier kromosomanalys 10, eller som tränar material för nybörjare i intracytoplasmatisk spermie injektion (ICSI). Å andra sidan kan musen hybrid B6CBAF1 embryon vid pronuclear eller 2-cell stadier användning i human assisterad befruktning centra eller i forskningslaboratorier för att kontrollera kvaliteten på medierna embryot kultur eller väl fungerande inkubatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det spanska Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 till 11.792) och Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Författarna vill tacka Marc Puigcerver och Jonatan Lucas för tekniskt bistånd vid utarbetandet av media. All personal från Servei d'Estabulari är känd för djurstallar och i synnerhet Juan Jose Martin och Javier Benito för deras ytterligare bidrag för inspelning del av denna video. NCB är en karl i den portugisiska Fundação para en Ciencia e Tecnologia och SG är en karl av den spanska Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
