Summary
In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.
Abstract
Embrioni e ovociti crioconservati con successo sono stati più di 30 anni fa, quando Whittingham
Protocol
La cura degli animali e le procedure sono state condotte secondo le linee guida e regolamenti approvati dal Comitato Etico per animali e la ricerca umana della Universitat Autònoma di Barcellona, in Spagna.
I. ovociti collezione
- Controllare e selezionare criceti femmina (Mesocricetus auratus; 8-12 settimana di età) del ceppo d'oro siriano per la presenza di uno scarico di spessore vaginale (scarica fase postovulatoria).
- Indurre femmine selezionati per superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 40 UI di PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina), seguita da 40 UI di hCG (gonadotropina corionica umana) 60 ore dopo.
- Euthanize criceti femmina 16 ore dopo la somministrazione di hCG in una camera di anidride carbonica.
- Isolare ovidotti dalle femmine, come mostrato nel video e trasferirli su una goccia di KSOM-H media.
- Raccogliere ovocita-cumulo complessi strappando l'ampolla ovidotto sotto un microscopio stereoscopico in una goccia di ialuronidasi (156 U / ml) a 37 ° C. Ovociti sarà liberato da cellule del cumulo in circa 5 minuti.
- Pick up ovociti da ialuronidasi e lavarli due volte in KSOM-H media.
Per la raccolta di embrioni di topo, topi di sesso femminile (Mus musculus, 6-8 settimane di età) sono indotti a superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 5 UI di PMSG seguito da 5 UI di hCG dopo 48 ore e accoppiati con topi di sesso maschile. Le femmine sono sacrificati per dislocazione cervicale a 24-26, 44-46 o 54-56 ore dopo la somministrazione di hCG per ottenimento dei pronuclei, 2-4-cell o cellule di embrioni fase, rispettivamente. Raccolta di embrioni pronuclei viene eseguita esattamente come descritto per ovociti di criceto. Embrioni nelle fasi di 2-celle e 4-celle vengono raccolti svuotando la ovidotti con KSOM-H media [6].
Nota: A seguito di questo protocollo circa 20 o 30 ovociti / embrioni possono essere raccolti da ogni femmina.
II. Preparazione di gelo e disgelo soluzioni
- Preparare la soluzione mi diluendo 0,57 ml di propilenglycol in 5 ml di KSOM-H (1,5 M di propilenglycol).
- Preparare la soluzione disgelo con l'aggiunta di 2 ml di KSOM-H ad un tubo con 0,2052 g di saccarosio (0,3 M di saccarosio).
- Preparare la soluzione di congelamento con l'aggiunta di 2 ml di soluzione che ho ad un tubo con 0,0684 g di saccarosio (1,5 M di saccarosio propilenglycol e 0,1 M).
Nota: I Solution e il congelamento e scongelamento soluzioni devono essere preparate poco prima del loro utilizzo. Tuttavia, la determinata quantità di saccarosio da utilizzare per la preparazione delle soluzioni di congelamento e scongelamento può essere ponderata in anticipo e conservati in 3 ml tubi a temperatura ambiente per diversi mesi.
III. Protocollo di congelamento
- Ovociti trasferimento / embrioni dal KSOM-H medio-una goccia di soluzione di I e incubare per 7-15 minuti a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, preparare un piatto di 90 millimetri di Petri per caricare il cannucce mettendo 90 gocce ml di congelamento e scongelamento soluzioni come viene mostrato nel video (1 goccia di ogni soluzione / paglia).
- Trasferire il numero desiderato di ovociti / embrioni per le gocce soluzione di congelamento.
Nota: Di solito trasferimento tra 5-30 ovociti o embrioni / drop. - Allegare una cannuccia in un sistema controllato aspirazione bocca e caricarlo seguendo questo ordine: soluzione che, d'aria, con la caduta di congelamento degli ovociti, aria, calo di scongelamento, aria.
- Una volta la paglia viene caricato, mantenere l'aspirazione fino a quando la prima goccia introdotto (soluzione che ho) raggiunge il polimero alla fine superiore della paglia e tenute questo fine. Thermo-seal l'altra estremità della paglia o di tenuta con un tappo in plastica.
- Accendere il congelatore programmabile e selezionare il programma di congelamento. Il programma di congelamento utilizzato in questo protocollo si basa sulla velocità di raffreddamento originariamente pubblicato da Lassalle et al. [7]:
- 2 ° C / min dalla temperatura ambiente a -7 ° C
0 ° C / min per 10 minuti per consentire l'equilibrio di temperatura e di induzione di semina (vedi sotto) - 0,3 ° C / min da -7 ° C a -30 ° C
0 ° C / min per 2 minuti per consentire l'equilibrio di temperatura - 35 ° C / min da -30 ° C a -130 ° C
- 2 ° C / min dalla temperatura ambiente a -7 ° C
- Caricare le cannucce sugli slot del titolare del congelatore programmabile, assicurandosi che la parte della paglia con la goccia di soluzione di scongelamento è rivolto verso l'esterno. Avviare il programma di congelamento.
- Quando la temperatura del campione raggiunge i -7 ° C ed il raffreddamento è in attesa, effettuare la semina manuale: tuffo la pinza in azoto liquido, tirare i titolari un po 'fuori dal freezer per esporre la parte del cannucce contenente le gocce di soluzione di scongelamento, e subito tocco questa parte del cannucce con le pinze. Ripetere per ogni titolare e ogni paglia nel supporto, e poi lasciare che il programma di congelamento fino alla fine.
- Quando il programma è completato, i titolari tuffo in azoto liquido.
- Rimuovere le cannucce daltitolari e loro trasferimento in un alberello con etichetta.
- Infine, memorizzare i alberello all'interno di un serbatoio di azoto liquido.
IV. Scongelamento protocollo
- Rimuovere la cannuccia dal serbatoio di azoto liquido.
- Mantenere la paglia a temperatura ambiente per 40 secondi.
- Mettere a bagno la paglia in un bagno d'acqua a 30 ° C durante 40 secondi.
- Togliere la spina dalla paglia o tagliare il termosaldata punta.
- Svuotare la paglia in un 35-mm piastra di Petri e mescolare delicatamente le due gocce contenenti le soluzioni di congelamento e scongelamento.
- Lascia ovociti / embrioni nella miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferimento ovociti / embrioni di un calo fresco di KSOM-H per altri 15 minuti a 37 ° C.
- Ovociti / embrioni sono ora pronti per ulteriori manipolazioni.
Nota: Durante i passi 6 e 7 si dovrebbe vedere che gli ovociti scongelati / embrioni lentamente si gonfiano a causa di reidratazione.
V. Rappresentante Risultati
L'utilizzo del protocollo di crioconservazione qui riportati si traduce in un tasso di sopravvivenza di circa il 95% per ovociti di criceto e del> 90%, 85% e 80% per il mouse B6CBAF1 embrioni al pronucleo, 2-cell stadi e 4-celle, rispettivamente. Quando sono embrioni di topo coltivati in vitro in KSOM dopo lo scongelamento, almeno 70 al 80% dovrebbe arrivare allo stadio di blastocisti in condizioni di coltura ottimali.
Si raccomanda di includere un gruppo di controllo (paglia) di ovociti / embrioni in ogni esperimento di congelamento e di scongelamento questo gruppo prima del resto degli ovociti / embrioni vengono utilizzati per ulteriori manipolazioni. Se i tassi di sopravvivenza per il gruppo di controllo sono inferiori alle attese, disgelo un'altra paglia dello stesso lotto. Se i tassi di sopravvivenza per questo secondo gruppo sono bassi, scartare il restante cannucce da questo lotto di congelamento.
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Discussion
Con questo protocollo e ovociti di criceto embrioni di topo possono essere crioconservati con successo. Una volta congelati, gli ovociti / embrioni possono essere conservati in serbatoi di azoto liquido a tempo indeterminato e recuperato in qualsiasi momento o luogo desiderato. Questo offre il vantaggio di avere campioni quasi pronto per l'uso in caso di necessità. D'altra parte, questo protocollo può essere utilizzato anche per generare criobanche embrione di ceppi di topi di valore (come linee transgeniche), come alternativa economica e più sicura per il mantenimento delle colonie di animali vivi. E 'importante notare che questo protocollo è ottimizzato per crioconservare gli ovociti di criceto e ibridi embrioni di topo B6CBAF1. Differenze nella post-disgelo tassi di sopravvivenza tra embrioni di topo con differenti background genetico sono stati descritti 8,9, quindi occorre prestare attenzione per valutare le condizioni di crioconservazione di ogni specie o ceppo di ovociti / embrioni e di stabilire il protocollo appropriato prima che la generazione di ovocita o embrione criobanche.
Ovociti di criceto può essere utilizzato in umana cliniche di riproduzione assistita per il test di penetrazione degli spermatozoi o per l'analisi dello sperma cromosoma 10, o come pratica materiale per i principianti a iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI). D'altra parte, il mouse ibrido B6CBAF1 embrioni in fasi pronuclei o 2-cellulare può essere utilizzato in centri di riproduzione umana assistita o nei laboratori di ricerca per verificare la qualità dei terreni di coltura l'embrione o il corretto funzionamento degli incubatori.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministerio de Educación y spagnolo Ciencia (BIO 2006-11792) e la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano Marc Puigcerver e Jonatan Lucas per la loro assistenza tecnica per la preparazione dei mezzi. Tutto il personale da d'Servei Estabulari è riconosciuto per la stabulazione degli animali, e soprattutto Juan Jose Martin e Javier Benito per il loro contributo supplementare a registrare parte di questo video. BCN è un collega del portoghese Fundação para a Ciência e Tecnologia e SG è un compagno dello spagnolo Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
