Summary
Neste vídeo-artigo apresentamos uma demonstração passo-a-passo sobre como coletar e criopreservar oócitos de hamster com altas taxas de sobrevivência pós-descongelamento. O mesmo procedimento também pode ser aplicado com sucesso congelar e descongelar embriões de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento pré-implantação.
Abstract
Embriões e oócitos criopreservados com sucesso pela primeira vez mais de 30 anos atrás, quando Whittingham
Protocol
Cuidados com os animais e os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e as normas aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal e Humana da Universitat Autònoma de Barcelona, Espanha.
I. coleta de oócitos
- Verifique e selecione hamsters feminino (Mesocricetus auratus; 12/08 semana de idade) da cepa de Ouro da Síria para a presença de um corrimento vaginal espesso (descarga pós-ovulatória).
- Induzir fêmeas selecionadas para superovulate por injeção intraperitoneal de 40 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), seguido de 40 UI de hCG (gonadotropina coriônica humana) 60 horas depois.
- Euthanize hamsters fêmeas 16 horas após a administração de hCG em uma câmara de dióxido de carbono.
- Isolar ovidutos das fêmeas, como mostrado no vídeo e transferi-los para uma queda de KSOM-H médio.
- Coletar oócitos cumulus complexos rasgando a ampola do oviduto sob um microscópio estereoscópico em uma gota de hialuronidase (156 U / ml) a 37 ° C. Oócitos serão liberados a partir de células cumulus em cerca de 5 minutos.
- Pick up ovócitos de hialuronidase e lavá-los duas vezes em KSOM-H médio.
Para a coleta de embriões de camundongos, ratos fêmeas (Mus musculus; 6-8 semana de idade) são induzidos a superovulate por injeção intraperitoneal de 5 UI de PMSG seguido por 5 UI de hCG 48 horas mais tarde e acasaladas com ratos machos. As fêmeas são sacrificadas por deslocamento cervical em 24-26, 44-46 ou 54-56 horas após a administração de hCG para obtenção de pronuclear, 2 de células ou embriões de 4 células estágio, respectivamente. Colheita de embriões pronuclear é realizado exatamente como descrito para oócitos de hamster. Embriões nas fases 2 e 4 células de células são recolhidas através de lavagem com o ovidutos KSOM-H médio [6].
Nota: Na sequência deste protocolo aproximadamente 20 a 30 oócitos / embriões podem ser coletadas de cada fêmea.
II. Preparação de soluções de congelamento e descongelamento
- Prepare solução que eu diluindo 0,57 ml de propilenglycol em 5 ml de KSOM-H (1,5 M de propilenglycol).
- Prepare a solução de descongelamento, adicionando 2 ml de KSOM-H para um tubo com 0,2052 g de sacarose (0,3 M de sacarose).
- Preparar a solução de congelamento, adicionando 2 ml de solução I a um tubo com 0,0684 g de sacarose (1,5 M de sacarose e 0,1 propilenglycol M).
Nota: Eu Solution e congelamento e descongelamento, as soluções devem ser preparadas imediatamente antes de seu uso. No entanto, as quantidades especificadas de sacarose a ser usada para a preparação do congelamento e descongelamento soluções podem ser ponderados com antecedência e armazenado em 3 ml de tubos em temperatura ambiente por vários meses.
III. Protocolo de congelamento
- Ovócitos transferência / embriões a partir do meio KSOM-H para uma gota de solução I e incubar por 7-15 minutos em temperatura ambiente.
- Enquanto isso, prepare uma placa de Petri 90 milímetros para carregar a palha, colocando 90 gotas mL de congelamento e descongelamento soluções como é mostrado no vídeo (1 gota de cada solução / palha).
- Transferir o número desejado de oócitos / embriões para as gotas de solução de congelamento.
Nota: Nós normalmente transferência entre 5 a 30 oócitos ou embriões / gota. - Anexar uma palha para um sistema de aspiração de boca controlada e carregá-lo seguindo esta ordem: solução I, do ar, queda de congelamento com os oócitos, ar, queda de descongelamento, o ar.
- Uma vez que a palha é carregada, manter aspiração até que a primeira gota introduzido (solução I) atinge o polímero no topo do canudo e sela o fim. Termo-selar o outro lado da palha ou selar com um plugue de plástico.
- Ligue o freezer programável e selecione o programa de congelamento. O programa de congelamento utilizado neste protocolo é baseado nas taxas de resfriamento publicado originalmente por Lassalle et al. [7]:
- 2 ° C / min da temperatura ambiente até -7 ° C
0 ° C / min para 10 min para permitir equilíbrio de temperatura e indução de semeadura (veja abaixo) - 0,3 ° C / min de -7 ° C a -30 ° C
0 ° C / min por 2 min para permitir equilíbrio de temperatura - 35 ° C / min de -30 ° C a -130 ° C
- 2 ° C / min da temperatura ambiente até -7 ° C
- Carregar os canudos nos slots do titular do congelador programável, certificando-se que a parte da palha com a gota de solução descongelamento é voltado para fora. Inicie o programa de congelamento.
- Quando a temperatura da amostra atinge -7 ° C ea refrigeração está em espera, executar semeadura manual: mergulhar a pinça em nitrogênio líquido, puxe os titulares um pouco fora do freezer para expor a parte da palha contendo as gotas de solução de descongelamento, e imediatamente toque nesta parte do canudos com o fórceps. Repita a operação para cada titular e cada um de palha no suporte, e deixar que o programa de congelamento de correr até o fim.
- Quando o programa estiver concluído, mergulhe os titulares em nitrogênio líquido.
- Retire as palhas datitulares e transferi-los para um gobelet rotulados.
- Finalmente, guarde o gobelet dentro de um tanque de nitrogênio líquido.
IV. Descongelamento protocolo
- Remover a palha do tanque de nitrogênio líquido.
- Manter a palha em temperatura ambiente por 40 segundos.
- Mergulhe a palha em banho-maria a 30 ° C durante 40 segundos.
- Retire a ficha da palha ou cortar a ponta termo-selado.
- Esvaziar a palha numa placa de Petri de 35 mm e misture delicadamente as duas gotas que contêm o congelamento e descongelamento soluções.
- Deixe oócitos / embriões na mistura por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Transferência de oócitos / embriões frescos para uma queda de KSOM-H para um adicional de 15 minutos a 37 ° C.
- Oócitos / embriões estão agora prontos para manipulação posterior.
Nota: Durante as etapas 6 e 7 você verá que os oócitos descongelados / embriões lentamente inchar devido à reidratação.
Representante Resultados V.
O uso do protocolo de criopreservação aqui relatados resulta em uma taxa de sobrevivência de cerca de 95% para oócitos de hamster e de> 90%, 85% e 80% para mouse B6CBAF1 embriões no pronuclear, 2-estágios e de célula de 4 células, respectivamente. Quando embriões de camundongos são cultivadas in vitro em KSOM após o descongelamento, pelo menos 70 a 80% devem chegar ao estágio de blastocisto em condições de cultura ideal.
É recomendado que você incluir um grupo controle (palha) de oócitos / embriões em cada experimento de congelamento e descongelamento que este grupo antes do resto dos oócitos / embriões são usados para manipulação posterior. Se as taxas de sobrevivência para o grupo controle é menor do que o esperado, descongele outra palha do mesmo lote. Se as taxas de sobrevivência para este segundo grupo também são baixos, descarte as palhetas restantes deste lote de congelamento.
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Discussion
Com este protocolo de oócitos e embriões hamster rato pode ser criopreservados com sucesso. Uma vez congelados, os oócitos / embriões podem ser armazenados em tanques de nitrogênio líquido por tempo indeterminado e recuperado a qualquer momento ou local desejado. Isto oferece a vantagem de ter amostras quase pronto para uso sempre que necessário. Por outro lado, este protocolo também pode ser usado para gerar cryobanks embrião de linhagens de camundongos valiosos (como linhagens transgênicas), como uma alternativa econômica e segura para a manutenção de colônias de animais vivos. É importante notar que este protocolo é otimizado para criopreservar oócitos de hamster e híbridos embriões de camundongos B6CBAF1. Diferenças nas taxas de sobrevivência pós-descongelamento entre os embriões de ratos de diferentes origens genéticas foram descritas 8,9, portanto, cuidados devem ser tomados para avaliar as condições de criopreservação de cada espécie ou cepa de oócitos / embriões e estabelecer o protocolo apropriado antes que a geração de oócitos ou cryobanks embrião.
Oócitos de hamster podem ser usados em humanos clínicas de reprodução assistida para o teste de penetração espermática ou para análise do esperma cromossomo 10, ou como praticantes de material para iniciantes na injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Por outro lado, mouse híbrido B6CBAF1 embriões em estágios pronuclear ou 2 células podem ser usadas em humanos centros de reprodução assistida ou em laboratórios de pesquisa para verificar a qualidade dos meios de cultura do embrião ou o bom funcionamento das incubadoras.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Ministerio de Educación y espanhol Ciencia (BIO 2006-11792) e da Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Autores gostariam de agradecer Marc Puigcerver e Jonatan Lucas para a sua assistência técnica na preparação dos meios de comunicação. Todo o pessoal da d'Servei Estabulari é reconhecido por alojamento dos animais e, especialmente, Juan Jose Martin e Javier Benito para a sua contribuição adicional sobre a gravação parte deste vídeo. BCN é um companheiro da Fundação Português parágrafo a Ciência e Tecnologia e SG é um companheiro do espanhol Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U.
- Vajta, G., Kuwayama, M.
- Duselis, A. R., Vrana, P. B.
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
