Summary
Использование высокой частоты электрической стимуляции, арест-подобной активности может быть вызван в
Abstract
Дрозофилы является полезным инструментом для изучения, как захват деятельности. Разнообразие мутантов, в которых припадки могут быть вызваны либо через физическое током или электрической стимуляции доступен для изучения различных аспектов деятельности захват и поведение. Все мухи, в том числе дикого типа, будет проходить приступов, как деятельность, если стимулировали на достаточно высоком напряжении. Захват, как деятельность все или ничего реагирования и каждый генотип имеет определенный порог захвата. Судорожный порог конкретного генотипа летать может быть изменена либо путем обработки наркотика или генетического подавления или аксессуара. Порог легко измеряется электрофизиологии. Захват-подобную активность может быть вызвана с помощью высокой частоты электрической стимуляции непосредственно на мозг и записаны через спинные продольные мышцы (DLMS) в грудной клетке. DLMS иннервируются часть гигантской системы волокна. Начиная с низкого напряжения, высокой частоты стимуляции, а в дальнейшем повышении напряжения с небольшим шагом, судорожный порог для одного летать могут быть измерены.
Protocol
Изготовление образцов:
В ночь перед экспериментом, мужской мух желаемого генотипа наркоз и помещают в пробирку с мягкой плагин нейлона. Ватным тампоном также будет работать. После обезболивания, судорожный порог изменяется, так что мухи лучше оставить по крайней мере 6 часов, хотя по ночам это идеальный вариант.
В день эксперимента, мухи установлены по одному на стеклах со слоем зубных слепков с одной стороны.
Один муха подобрал головку с помощью иглы 23 (с острым кончиком отрезать), подключенных к вакуумной линии.
Муха затем прикрепляется к воска на слайде, нажимая ногами и крыльями в воск.
Как только муха иммобилизованные, воск выталкивается вверх вокруг шеи и глаза, чтобы полностью обездвижить голову.
Электрофизиология:
Муха, которая в настоящее время смонтированы и готовы к работе помещается в электрофизиологии создана.
Набор электрофизиологии до состоит из трех наборов микроманипуляторами, каждый с 1:59 заостренными электродами, прикрепленными вольфрама. Напряжение обеспечивается стимулятор, который подключен к изоляторе придается стимулирующие электроды. Запись электрод соединен с предварительного усилителя, в свою очередь подключен к цифровой осциллограф. Хотя это не является существенным, оно полезно иметь спикер подключен к осциллографу, так что ответы могут быть слышны.
Боковой электрод вставляют в живот летать.
Запись электрод вставляется в один из Спинной продольные мышцы в грудной клетке летать.
Стимулирующие электроды вставляются в голову. Один в стороне от каждого глаза.
Стимулятор должны иметь следующие параметры для запуска: Непрерывный интервал импульса с 2-х секунд между каждым импульсом. Там должно быть никакой задержки импульса. Длительность импульса должна быть 0,2 мс.
Осциллографа должна иметь функцию хранения включен и иметь следующие параметры: Время / DIV должен быть установлен в 1ms/DIV. Вольт / DIV должен быть установлен на любом 0.1V/DIV или 50 мВ / дел.
Гигантские порог волокна определяется доставки одиночных импульсов и отмечая, минимальное напряжение, необходимое для получения ответа. Это напряжение обычно составляет 2 В.
После гигантского волокна порог был определен, остановить пульсирующий летать и изменить настройки на осциллограф: 0,2 с / дел
Параметры стимулятор должен быть изменен на: интервал импульса должен быть установлен в одном. Поезд должен быть включен и настроен на 3 секунды. Сигнал параметрами являются: 0,5 мс импульсов на 200 Гц в течение 300 мс. Напряжение изменяется в нужное положение и высокочастотных импульсов поступает в мозг мухи.
Если изъятие не индуцируется, осциллограмма покажет плоская линия после поезда. Если настройки быстро установить обратно в исходное настройки, одиночных импульсов будет вызывать отклик в гигантские системы волокна.
Если захват индуцируется, осциллограф покажет захват-подобной активности после поезда. Если настройки быстро переключаться обратно на первоначальные настройки, одиночные импульсы не сможет активировать ответ в гигантские системы волокна.
Мухи рефрактерный период после высокочастотный стимул wavetrain, в котором захват, как деятельность, не могут быть вызваны. Если не происходит захват мухи огнеупорных примерно 7 минут. Если захват индуцируется, мухи рефрактерный период около 17 минут.
При определении порога, дополнительные высокочастотные стимулы могут быть доставлены в тот же летать (после подходящее время для рефрактерный период), пока порог определяется или до гигантских ответ волокно становится слишком слабым, чтобы видеть.
После эксперимент завершен, летать будет удален из электрофизиологии создана, освобожден из воска, и утилизировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это видео продемонстрировали основные шаги в определении порога захвата отдельных мушки дрозофилы. Вместо того чтобы использовать цифровой осциллограф, компьютеризированные дигитайзер также может быть использован. Этот метод полезен для определения влияния препарата или генетические изменения на захват порог летать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательский грант NIH, эпилепсия грант Фонда и Макнайт грант Фонда к МП Опыты на плодовых мух дрозофил были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными животных UC комитета Используйте Беркли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
