Summary
Yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu, nöbet benzeri aktivite kullanma uyarılabilir
Abstract
Drosophila melanogaster aktivite gibi nöbet çalışmak için yararlı bir araçtır. Nöbetler ya fiziksel şok ya da elektrik stimülasyonu ile indüklenen olabilir mutantlar çeşitli nöbet aktivite ve davranış çeşitli yönleriyle çalışma için kullanılabilir. Eğer yeterince yüksek bir voltaj uyarılmış yabani tip dahil olmak üzere tüm sinekler, nöbet benzeri aktivite uğrayacaktır. Nöbet aktivitesi gibi bir ya hep ya hiç yanıt ve her genotip belirli bir nöbet eşiğini vardır. Sinek belirli bir genotip nöbet eşiğini bir ilaç tedavisi ya da genetik baskılanması ya da donanım tarafından değiştirilebilir. Eşiği kolayca elektrofizyoloji ile ölçülür. Gibi nöbet aktivite-beyne doğrudan teslim ve toraks dorsal longitudinal kasları (DLMS) aracılığıyla kaydedilen yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu ile indüklenen olabilir. DLMS dev fiber sistemi tarafından innerve. Düşük voltajlı, yüksek frekanslı stimülasyon ile başlayan ve daha sonra küçük artışlarla gerilimi yükselterek, bir sinek için nöbet eşiğini ölçülebilir.
Protocol
Numune Hazırlama:
Deneyden önce gece, istenilen genotip erkek sineklerin, anestezisiz ve yumuşak bir naylon fiş ile bir şişe yerleştirilir. Bir pamuk da çalışmaya devam eder. Anesthetization ardından, nöbet eşiğini değişir, gece ideal olsa da üzerinde, sineklerin en iyi, en az 6 saat süreyle bırakılır.
Deney günü, sinekler, bir tarafta diş balmumu tabakası ile cam slaytlara bir defada bir monte edilir.
Tek bir sinek, bir vakum hattına bağlı bir 23 iğne (sivri ucu kesilmiş ile) kullanarak kafayı kaldırdı.
Sinek sonra slayt balmumu, balmumu içine bacaklarını ve kanatlarını basarak yapıştırılmıştır.
Sinek immobilize sonra, mum boynunuza kadar itilir ve gözleri kafası tamamen hareketsiz hale getirmek.
Elektrofizyoloji:
Şimdi gitmek için hazır monte edilmiş ve elektrofizyoloji yerleştirilir sinek kurdu.
Elektrofizyoloji kurmak mikromanipülatörler üç set, her biri ile bağlı iki bilenmiş tungsten elektrot oluşur. Gerilim uyarıcı elektrotlar bağlı bir izolasyon ünitesine bağlı bir stimülatörü tarafından sağlanmaktadır. Kayıt elektrot da bir dijital depolama osiloskop bağlı bir pre-amp bağlıdır. Gerekli olmasa da, yanıtları sesli böylece osiloskop bağladım bir hoparlör için yararlıdır.
Bir toprak elektrot sinek karın içine sokulur.
Kayıt elektrodu sinek toraks Dorsal Boyuna Kaslar biri haline sokulur.
Uyarıcı elektrotlar kafa içine eklenir. Her göz tarafına biri.
Her darbe arasında 2 saniye ile sürekli darbe aralığı: stimülatörü aşağıdaki ayarları başlatmak zorundadır. Darbe gecikme olmamalıdır. Darbe genişliği 0.2ms olmalıdır.
Osiloskop depolama özelliği açık ve aşağıdaki ayarlara sahip olmalıdır: Zaman / DIV 1ms/DIV ayarlanmış olmalıdır. Volt / DIV 0.1V/DIV veya 50 mV / DIV da ayarlanması gerekir.
Dev fiber eşik tek bakliyat sunan ve bir yanıt almak için gereken minimum gerilim belirterek belirlenir. Bu gerilim, genellikle yaklaşık 2 V.
Dev fiber eşiği tespit edildikten sonra, sinek darbeli durdurmak ve osiloskop ayarları değiştirin: 0.2 S / DIV
Stimülatör ayarları değiştirilmesi gerektiğini darbe aralığı tek olmalıdır. Tren açık ve 3 saniye olarak ayarlanmış olmalıdır. Dalga parametreler şunlardır: 200Hz'de 300 ms 0,5 ms bakliyat. Gerilimi istenilen ayarı ve sinek beyin teslim bakliyat yüksek frekanslı bir tren değiştirildi.
Bir nöbet indüklenen değilse, osiloskop iz tren sonra düz bir çizgi gösterecektir. Ayarlarını hızlı başlangıç ayarlarına geri ayarlarsanız, tek bakliyat dev fiber sistemi bir yanıt neden olacaktır.
Bir nöbet neden ise, osiloskop tren sonra nöbet gibi faaliyet gösterecektir. Ayarlarını hızlı bir şekilde orijinal ayarlarına geri anahtarlamalı, tek bakliyat dev fiber sistemi bir yanıt etkinleştirmek için başarısız olur.
Sinekler aktivite gibi nöbet indüklenen edilemeyen bir yüksek frekanslı uyaran wavetrain sonra refrakter dönem var. Sinekler, yaklaşık 7 dakika boyunca hiç nöbet oluşursa dirençli. Bir nöbet neden ise, sinekler, yaklaşık 17 dakikalık bir refrakter süre var.
Eşik belirlenir kadar veya eşik belirlerken dev fiber yanıtı görmek için çok zayıf hale gelinceye kadar, ilave yüksek frekanslı uyaranlar aynı sinek (refrakter dönem için uygun bir zaman sonra) teslim edilebilir.
Deney tamamlandıktan sonra, sinek elektrofizyoloji kaldırılır kurmak, balmumu salınan ve bertaraf edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video, bireysel bir Drosophila sineği nöbet eşiğini belirleyen temel adımları ortaya koymuştur . Dijital osiloskop kullanarak yerine, bilgisayarlı sayısallaştırıcı de kullanılıyor olabilir. Bu teknik, bir sineğin nöbet eşiğini bir ilaç ya da genetik değişiklik etkilerini belirlemek için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, bir araştırma NIH hibe, Epilepsi Vakfı'nın hibe ve McKnight Vakfı Hibe UC Berkeley Hayvan Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak MT Drosophila meyve sinekleri üzerindeki deneyler yapıldı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
