Summary
Uso de alta frecuencia de estimulación eléctrica, actividades similares a convulsiones pueden ser inducidos en
Abstract
Drosophila melanogaster es una herramienta útil para el estudio de secuestro como actividad. Una variedad de mutantes en los que las convulsiones pueden ser inducidas a través de cualquiera de choque físico o estimulación eléctrica está disponible para el estudio de diversos aspectos de la actividad convulsiva y el comportamiento. Todas las moscas, incluso de tipo salvaje, se someterá a actividades similares a convulsiones si se estimula a un voltaje suficientemente alto. Convulsivos como la actividad es una respuesta de todo o nada y cada genotipo tiene un umbral de convulsiones específicas. El umbral de las convulsiones de un genotipo específico de la mosca puede ser alterado, ya sea por tratamiento con un fármaco o por la supresión o mejora genética. El umbral se mide fácilmente por electrofisiología. Actividades similares a convulsiones pueden ser inducidas a través de la estimulación eléctrica de alta frecuencia entregados directamente al cerebro y grabado a través de los músculos dorsales longitudinales (DLMS) en el tórax. El DLMS son inervados por parte del sistema de fibra gigante. A partir de la estimulación de baja tensión, alta frecuencia, y, posteriormente, elevar la tensión en incrementos pequeños, el umbral de las convulsiones de una sola mosca puede ser medido.
Protocol
Preparación de las muestras:
La noche antes del experimento, las moscas macho de genotipo deseado son anestesiados y colocados en un frasco con un tapón de nylon suave. Una bola de algodón también funcionaría. Después de anestesia, el umbral de convulsión se altera, por lo que las moscas lo mejor es dejar por lo menos 6 horas, aunque durante la noche es ideal.
En el día del experimento, las moscas se montan uno a la vez a las diapositivas de cristal con una capa de cera dental, por un lado.
Una sola mosca es recogido por la cabeza utilizando una aguja de calibre 23 (con la punta afilada de corte) conectado a una línea de vacío.
La mosca, fijada a la cera en la diapositiva empujando las patas y las alas en la cera.
Una vez que la marcha se inmoviliza, la cera se empuja hacia arriba alrededor del cuello y los ojos para inmovilizar totalmente la cabeza.
Electrofisiología:
La mosca, que ya está montado y listo para funcionar se coloca en la electrofisiología establecido.
El conjunto de electrofisiología consiste de tres series de micromanipulador, cada uno con uno o dos electrodos de tungsteno afilada adjunto. El voltaje es proporcionado por un estimulador que se conecta a una unidad de aislamiento conectado a los electrodos de estimulación. El electrodo de registro está conectado a un pre-amplificador que a su vez está conectado a un osciloscopio de almacenamiento digital. Si bien no es esencial, es útil disponer de un altavoz conectado al osciloscopio para que las respuestas se pueden hacer audible.
Un electrodo de masa se introduce en el abdomen de la mosca.
El electrodo de registro se inserta en uno de los músculos dorsales longitudinales en el tórax de la mosca.
Los electrodos de estimulación se insertan en la cabeza. Uno al lado de cada ojo.
El estimulador debe tener las siguientes opciones para comenzar: intervalo de pulso continuo con 2 segundos entre cada pulso. No debe haber ningún retraso del pulso. El ancho de pulso debe ser 0,2 ms.
El osciloscopio debe tener la característica de almacenamiento de encendido y tienen los siguientes valores: Tiempo / DIV se debe establecer en 1ms/DIV. Volts / DIV debe fijarse en cualquiera de 0.1V/DIV o 50 mV / DIV.
El umbral de fibra gigante se determina mediante la entrega de los pulsos individuales y teniendo en cuenta la tensión mínima necesaria para obtener una respuesta. Esta tensión es típicamente alrededor de 2 V.
Una vez que el umbral de fibra gigante se ha determinado, dejar de pulsar la marcha y cambiar la configuración en el osciloscopio para: 0.2 S / DIV
Los ajustes en el estimulador debe ser cambiado a: El intervalo de pulso se debe establecer en una sola. El tren debe estar encendido y configurado en 3 segundos. Los parámetros de forma de onda son: 0,5 ms pulsos a 200 Hz para 300 ms. La tensión se cambia a la configuración deseada y un tren de alta frecuencia de los pulsos se entrega al cerebro de la mosca.
Si un ataque no es inducida, el osciloscopio mostrará una línea plana después de que el tren. Si la configuración es configurar rápidamente a la configuración inicial, los pulsos de un solo causará una respuesta en el sistema de fibra gigante.
Si un ataque es inducida, el osciloscopio muestra la actividad convulsiva después de que el tren. Si la configuración es rápidamente cambió de nuevo a la configuración original, los pulsos de un solo dejará de activar una respuesta en el sistema de fibra gigante.
Las moscas tienen un periodo refractario después de una wavetrain estímulo de alta frecuencia en la que convulsivos como la actividad no puede ser inducida. Si no hay convulsión de las moscas son refractarios a unos 7 minutos. Si un ataque es inducida, las moscas tienen un periodo refractario de aproximadamente 17 minutos.
Cuando se determina el umbral, más estímulos de alta frecuencia puede ser entregado a la mosca de la misma (desde el momento apropiado para el período refractario) hasta que el umbral está determinado o hasta que la respuesta de fibra gigante es demasiado débil para verlo.
Después de que el experimento se ha completado, la mosca se elimina de la electrofisiología creado, liberado de la cera, y se eliminan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este vídeo ha demostrado los pasos básicos para determinar el umbral convulsivo de un individuo mosca Drosophila. En lugar de utilizar el osciloscopio digital, un digitalizador computarizada también se puede utilizar. Esta técnica es útil para determinar los efectos de una droga o la alteración genética en el umbral de las convulsiones de una mosca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH de investigación, una beca de Fundación de la Epilepsia y una beca de la Fundación McKnight a la experimentación con MT en moscas de la fruta Drosophila se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Comité de la Universidad de Berkeley el uso de animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
