Summary
在这里，我们描述了一个用于安装长期成像，双光子成像和组织损伤的技术，和时间推移共焦成像的斑马鱼胚胎的方法。
Abstract
斑马鱼长有被利用来研究时间推移成像的生活透明的胚胎发展的细胞和分子机制。在这里，我们描述的方法安装长期成像斑马鱼的胚胎，并演示如何自动捕获的时间推移，使用共聚焦显微镜图像。我们还描述了一种方法来创建控制，精确地破坏个人使用集中安装在双光子显微镜飞秒激光功率在斑马鱼的外周感觉轴突分支。成功的双光子干切断参数必须为每个显微镜进行了优化。定制的双光子显微镜和蔡司510焦/双光子提供了两个例子，我们将展示双光子干切断。
斑马鱼三叉神经感觉神经元1感官神经元特异性启动子驱动的转基因表达的GFP可以可视化。我们已经适应了这种斑马鱼三叉模式，以直接观察活的斑马鱼胚胎的感觉轴突再生。胚胎与tricaine麻醉和定位，因为它巩固了在琼脂糖下降。固定的胚胎被密封在一个充满成像与苯基硫脲嘧啶（PTU）林格室。我们已经发现胚胎可以在这些商会不断成像为12-48小时。一个单一的共聚焦图像，然后捕获，以确定所需的干切断的网站。双光子显微镜成像低，非破坏性的权力下的感觉轴突位于该地区的利益。放大所需的站点上的干切断后，功率增加，单一的，定义区域扫描足以切断轴突。然后设置多个位置的时间推移成像共聚焦显微镜直接观察到，从性轴索损伤恢复。
Protocol
第1部分：安装斑马鱼的胚胎长期成像
- 准备嵌入1％低熔点琼脂糖溶液。离子水在微波炉，分装成小管和储存在摄氏42度加热块加热溶解琼脂糖。
- 选择成像的胚胎，并用镊子轻轻拉出绒毛膜除了删除chorions。胚胎可以被放置在受精后22-24小时（HPF），抑制色素形成到5％的机动部队铃声的解决方案。这提高了成像的清晰度和表演的感觉神经轴突的双光子axotomies至关重要。如果允许形成的天然色素是，自体荧光掩盖轴突上的双光子显微镜。林格对斑马鱼的解决方案包含了116毫米氯化钠，氯化钾2.9毫米，1.8毫米氯化钙 2，和5mm的HEPES，pH值7.2 。
- 加入tricaine〜0.02％的机动部队林格麻醉胚胎。确保动物没有反应，然后再继续触摸。
- 准备长期的成像室，采用真空润滑脂玻璃或聚四氟乙烯环一侧固定到玻璃盖玻片。
- 一个胚胎转移到42度的琼脂糖溶液用玻璃吸管，照顾不转让的机动部队林格，然后转移到事先准备好的盖玻片一滴琼脂糖胚胎。
- 需要琼脂糖变硬胚胎的位置。请记住，成像室，将翻转当您完成，使盖玻片将排在前面。
- 如果你有一个机动的阶段，可以一次图像的多个地点，重复步骤每个胚胎1.4-1.6。
- 允许琼脂糖完全巩固，然后填写与0.02％tricaine的机动部队林格环。
- 应用真空润滑脂环（S）的另一侧，然后盖上载玻片上环（S）。翻转密封腔（S）。这些商会可用于直立或倒置显微镜成像。
第2部分：两个光子干切断变色龙钛蓝宝石激光使用一个定制的双光子显微镜
- 准备用于成像。在显微镜下的幻灯片固定地点安装胚胎（S）。与40X（0.8 NA）的水目标聚焦在一个胚胎。打开激光。我们已经能够再现可视化和损害的GFP表达神经元使用下列参数。要在一个非破坏性的力量可视化的轴突，设置激光的波长910纳米（nm）和一个功率为30毫瓦（mW的上市是权力的样品量）。打开图像处理软件。我们使用的ScanImage软件开发卡雷尔斯沃博达的实验室，2，3 。
- 新闻焦点的双光子激光扫描胚胎，找到你想axotomize轴突，捕获这个轴突的形象。马克的第一个和最后一个Z轴位置，获得的图像，并做出最大的Z堆栈投影。
- 在70X放大你想axotomize和停止扫描轴突的分支。增加兆瓦样品破坏电力180兆瓦，并执行与激光单次扫描。为此，我们设置的Z切片数量为1，按下“抓图”。切断轴突，这应该是足够的。方法的讨论，请参阅您的显微镜和实验的目标，以优化此过程。
- 缩小，降低功率30兆瓦，并拍摄图像。
第3部分：双光子干切断蔡司510焦/双光子显微镜
- 将安装在胚胎阶段，使用25X水的目标或其他合适的目标，把重点。
- 打开双光子（910纳米）和氩（488 nm）的激光多轨设置，以便它可以从一个切换到其他。虽然两个激光器用于检测绿色荧光蛋白，两个光子发射是用红色显示，和氩激光与绿色排放区分这两个。
- 使用氩激光，以确定一个轴突伤害。在z设置标志的第一个和最后一个光学部分。共聚焦图像，并创建一个最大的Z堆栈投影。
- 选择地区要受伤的轴突，使这一地区成为关注的焦点。氩激光关闭和开启双光子激光。 〜9％的传输，以确保轴突仍然集中在激光强度在双光子扫描标本。
- 点击“停止”按钮，使裁剪工具将提供。使用作物放大感兴趣的领域。通常我们放大〜70X（可变焦“模式”标签下检查）。在“渠道”标签变化的双光子传输到15-20％的传输〜9％的强度。
- 切断轴突激活“快速的XY”按钮约1秒钟，然后按下停止按钮，以避免过量的损害。轴突应该被看作是分散的碎片，如果程序工作。
- 为了确保轴突被损坏切换到488纳米氩激光，采取另一种共聚焦图像，并创建一个最大的投影。
第4部分：共焦成像时间推移蔡司LSM 510
- 准备用于成像。如果您使用了激烈的阶段，一定要关闭前至少30分钟，成立时间推移电影。在显微镜下的幻灯片固定地点安装胚胎（S）。聚焦在一个理想的空中目标的胚胎。我们使用20倍，0.5 NA的目标。打开蔡司LSM 510成像软件。打开相应的激光器，并成立所需的配置。现在，我们将描述一个长期长期成像蔡司LSM的多时间软件的详细协议。这些方法可以适用于在自己的显微镜成像软件的使用。
- 定义你的第一个胚胎多的时间窗口的位置和配置。打开扫描，舞台，和多的时间窗口。启动快速扫描的扫描窗口上。移动阶段所需的XY位置。马克在扫描窗口的第一个和最后的Z轴位置。按停止，然后月中旬，在扫描窗口。等待中间ž片完成扫描，然后按标记的位置，在舞台窗口。如果你只成像一个胚胎，单击“单位置”选项卡上多的时间窗口。点击“替换XYZ”，然后“保存配置。同意当记者问到覆盖以前的配置。继续到步骤4.4。如果你有一个机械化的阶段，你可以设置多个地点的多个胚胎形象。在这种情况下，你应该定义你的第一个位置的XYZ和配置之前选择“多个位置”选项卡。此外，请务必位置1，略低于“多个位置”选项卡的下拉菜单，在下拉菜单中的配置节说多禄1，在你点击保存配置。
- 定义您剩余的胚胎多的时间窗口的位置和配置。找到你的下一个胚胎，然后按扫描速度快，移动到所需的XY位置的阶段，并标记你的第一个和最后一个扫描窗口的Z位置。按停止，然后月中旬，在扫描窗口。等待中间ž片完成扫描，然后按标记的位置，在舞台窗口。点击“替换XYZ”。检查略低于“多个位置”选项卡的下拉菜单上的位置2，在下拉菜单中的配置节，多禄2说，然后点击“保存配置”。同意当记者问到覆盖以前的配置。重复这个过程中剩余的胚胎。
- 图像采集多禄窗口的设置参数。选择在“块列表”一节中的GR - gl选项，然后输入所需的号码组重复。这是共聚焦将获得的图像在每个位置的次数。在“参数”部分中输入所需的等待时间间隔。这是从一个成像重复开始的下一个重复的启动时间量。选择的配置节“ZStackXY”。输入您的基本文件名，在底部的部分。点击“选择图片DB”，并选择你的MDB。点击“选项”按钮。选择你的MDB文件夹来保存临时文件。检查“保持最终图像打开”，“最终的图像保存”，和“中间的Z堆栈”。选择等待的时间间隔。点击确定关闭选项窗口。点击“开始时间”。离开多时间窗口的成像时间的开放。
- 分析您的数据。当时间推移成像已经完成，多时间软件将编译所有到为每个位置的摘要文件的临时文件。如果你想停止电影完成之前，请务必按“完成”而不是“停止”，这样的总结文件将被创建。临时文件和摘要文件应被自动保存到指定的MDB文件夹。从LSM软件菜单，点击“3D视图”，然后“投影”。摘要在下拉菜单中选定的文件，点击“应用”。这将产生最大的Z堆栈的预测，每个共聚焦图像。在LSM软件菜单中，单击“文件”，然后“出口”。一系列tif文件保存最高的预测。然后，您可以创造出的TIF文件使用ImageJ或QuickTime Pro的系列电影。在LSM图像的轴突可以追溯到三个尺寸，使用图像分析软件（如MicroBrightfield NeuroLucida），生成详细的有关轴突形态的定量信息。
第5部分：代表结果
一个成功的实验，将导致蜂窝动态准确地表述的轴突从伤病中恢复。你的胚胎，将健康的成像后，无明显的变性和强烈的心跳。干切断应导致精确的损害，只有切断轴突的分支。不应该有任何损伤周围神经轴突和最小的细胞死亡。我们相信，我们看到的干切断〜50％的实验的网站直接在一个单一的表皮细胞死亡。如果你观察到更多的伤害，你应该优化你的两个光子的协议，如在讨论中所述。
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Discussion
我们用描述的正是axotomize外周感觉神经轴突和生活斑马鱼的胚胎中直接观察到再生的方法。长期时间推移在斑马鱼的共焦成像可用于观察在体内的发育过程。双光子干切断过程可以修改许多不同的实验目标。我们使用相同的一般程序消融整个三叉神经的感觉神经元胞体，放大细胞体内，而不是一个分支的末梢神经轴突。荧光识别任何类型的细胞，可以精确的损坏或集中功率飞秒激光烧蚀。我们受到启发，在几个其他系统的脉冲激光器用于创建局部损坏或烧蚀细胞 4,5,6以往的研究斑马鱼系统，完善这些技术。在对照实验中，我们证实，干切断是非常精确的：我们从来都没有损坏附近的轴突，即使他们是同一单元格的分支，只是偶尔受损的上皮细胞的轴突密切并列的。这种特殊性可以解释的事实，双光子激光激发强度与距离的联络点3,7平方下降。此外，由于从激发荧光团的能量以光损伤，周围的未标记的细胞可能会网开一面。
损坏轴突所需的激光功率激光，组织的深度，和你的实验目标的设立可能有所不同。如果你想更深损害轴突在胚胎，将需要更多的权力。这是最好的试图在一个低功率的干切断电源，然后逐步增加，直到你找到的金额将切断的轴突。一旦你已经确定适量的激光干切断电源，你应该能够以可重复使用这种激光功率，造成局部组织损伤。如果您发现，随着时间的推移更多的权力是需要创造一个干切断，激光和显微镜可能需要维护（例如，激光可对齐）。请确保您的激光正确对齐，清洁你的目标，检查的镜子。
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Acknowledgments
我们感谢马克寺崎初步意见，对利用双光子显微镜，创造局部组织损伤，凯西茹班安装时间推移成像的意见，并讨论Sagasti和Portera - Cailliau实验室。最初的实验中，只要在中，马伍兹霍尔海洋生物实验室的草基金会研究员。在Sagasti实验室的工作是支持由白厅基金会，该Klingenstein基金会和巴勒斯惠康生物科学基金事业奖补助。
References
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