שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Summary

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

Abstract

דג הזברה כבר מזמן מנוצל כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של פיתוח על ידי הדמיה זמן לשגות של העובר שקוף החיים. כאן אנו מתארים שיטה לעלות עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך להדגים כיצד להפוך את לכידתו של זמן לשגות תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כמו כן, אנו מתארים שיטה כדי ליצור נזק מבוקר, מדויקת ענפים בודדים של אקסונים חושית הפריפריה דג הזברה באמצעות כוח ממוקד של לייזר femtosecond רכוב על מיקרוסקופ שני הפוטונים. הפרמטרים עבור axotomy שני הפוטונים מוצלח חייב להיות מותאם לכל מיקרוסקופ. נדגים שני הפוטונים axotomy משני מיקרוסקופ אישית שני הפוטונים בנוי 510 Zeiss / confocal שני הפוטונים לתת שתי דוגמאות.

נוירונים דג הזברה חושית trigeminal ניתן דמיינו ב-GFP קו מהונדס המבטא מונע על ידי האמרגן תא עצב תחושתי ספציפי ^1. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה trigeminal דג הזברה ישירות לקיים התחדשות האקסון חושית חיים עוברי דג הזברה. עוברים מורדמים עם tricaine וממוקמים בתוך טיפת agarose כפי שהיא מחזקת. עוברים משותקת סגורים בתוך תא הדמיה מלאים phenylthiourea (PTU) האצבעות. מצאנו כי עוברי ניתן הדמיה ברציפות במשך 12-48 שעות בתאי אלה. תמונה confocal אחד הוא נתפס לאחר מכן כדי לקבוע את האתר הרצוי axotomy. האזור של עניין נמצא על מיקרוסקופ שני הפוטונים על ידי הדמיה אקסונים חושית תחת צריכת חשמל נמוכה שאינם מזיקים,. לאחר התקרבות באתר הרצוי axotomy, הכוח הוא גדל סריקה אחת של אזור מוגדר מספיק כדי לנתק את האקסון. הדמיה מרובים זמן לשגות במיקום מוגדר אז על מיקרוסקופ confocal ישירות לקיים axonal התאוששות מפציעה.

Protocol

חלק 1: עוברי דג הזברה הרכבה הדמיה לטווח ארוך

1. הכן 1% נמוך פתרון להמיס agarose להטבעת. ממיסים agarose במים DI על ידי חימום במיקרוגל, aliquot לתוך צינורות קטנים חנות בתוך גוש חימום על 42 מעלות צלזיוס.
2. בחר עוברים הדמיה ולהסיר chorions שלהם על ידי משיכתו בעדינות סיסית בנפרד עם מלקחיים. עוברים ניתן להציב לתוך פתרון 5% האצבעות PTU ב 22-24 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כדי לדכא היווצרות של פיגמנט. זה משפר את הבהירות של הדמיה הינה חיונית לביצוע שני הפוטונים axotomies של אקסונים חושית. אם פיגמנט טבעי מותר צורה, autofluorescence מאפילה על אקסונים מיקרוסקופ שני הפוטונים. האצבעות פתרון דג הזברה מכיל 116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ"מ CaCl _2, HEPES 5mm, pH 7.2.
3. הרדימי עוברים על ידי הוספת ~ tricaine 0.02% ל PTU האצבעות. הפוך את החיות בטוח לא מגיב למגע לפני שתמשיך.
4. הכינו את החדר לטווח ארוך הדמיה על ידי יישום גריז ואקום בצד אחד של טבעת זכוכית או טפלון ולתקן אותו להחליק על כיסוי זכוכית.
5. העברה חד העובר לתוך הפתרון agarose 42 מעלות עם pipet זכוכית, נזהר שלא להעביר יותר את האצבעות PTU, ולאחר מכן להעביר את העובר עם טיפה אחת agarose להחליק על כיסוי מוכן.
6. מקם את העובר הרצוי כמו agarose מתקשה. זכור כי הקאמרית הדמיה יהיה התהפך כשתסיים כך להחליק לכסות יהיה המשטח העליון.
7. אם יש לך במה ממונע ובמקומות תמונה מרובות בבת אחת יכול, חזור על שלבים 1.4-1.6 עבור העובר כל אחד.
8. אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין, ולאחר מכן למלא את הטבעת עם 0.02% tricaine PTU האצבעות.
9. למרוח משחה ואקום לצד השני של הטבעת (ים), ואז לכסות את הטבעת (ים) עם זכוכית שקופית. תהפכו את חדר אטום (ים) מעל. לשכות אלה יכולים לשמש עבור הדמיה על מיקרוסקופים זקוף או הפוך.

חלק 2: שני הפוטונים axotomy באמצעות אישית בנוי שני הפוטונים מיקרוסקופ עם TI-Sapphire Chameleon לייזר

1. היכונו הדמיה. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחת עם מטרה (0.8 NA) 40X מים. הפעל את הלייזר. אנחנו כבר יכולים לדמיין reproducibly ונזק GFP להביע הנוירונים באמצעות הפרמטרים הבאים. כדי להמחיש אקסונים בהספק שאינו מזיק, הגדר לייזר באורך גל של 910 ננומטר (ננומטר) וכוח של 30 milliwatts (mW המפורטים הם את כמות החשמל בבית המדגם). פתח את תוכנת הדמיה. אנו משתמשים בתוכנה ScanImage שפותחה במעבדתו של קארל סוובודה ^{2, 3.}
2. לחצו להתמקד כדי לסרוק את העובר עם לייזר שני הפוטונים, אתר את האקסון ברצונך axotomize, ו ללכוד תמונה של האקסון הזה. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה, לרכוש את התמונה, ולעשות השלכה המרבי של ערימות Z.
3. הגדלה 70X על ענף של האקסון ברצונך axotomize ולהפסיק סריקה. הגדלת mW על המדגם לכוח המזיקות של 180 mW, ולבצע סריקה אחת עם הלייזר. אנו עושים זאת על ידי הגדרת מספר פרוסות ת'עד 1 ולחיצה על "גזל". זה אמור להיות מספיק כדי לנתק את האקסון. ראה דיון על שיטות לייעל את הליך זה עבור מיקרוסקופ שלך המטרה ניסיוני.
4. זום החוצה, ולצמצם את כוח 30 mW ולקחת תמונה.

חלק 3: שני הפוטונים axotomy על Zeiss 510 מיקרוסקופ confocal / שני הפוטונים

1. המקום רכוב עובר לבמה ולהביא אותו אל המוקד באמצעות המטרה מים 25X או מטרה מתאים אחר.
2. הפעל את שני הפוטונים (910 ננומטר) ארגון (488 ננומטר) לייזרים בסביבה מרובת המסלול, כך שאפשר לעבור מאחד לשני. למרות שגם לייזרים המשמשים לאיתור GFP, פליטת שני פוטונים הוא דמיינו עם אדום, ואת פליטת לייזר עם ארגון ירוק כדי להבדיל בין השניים.
3. השתמש לייזר ארגון לזהות האקסון לפגוע. תחת הגדרות Z לסמן את הסעיפים אופטי הראשונה והאחרונה. קחו תמונה confocal וליצור הקרנת המקסימלי של מחסנית Z.
4. בחר את האזור של האקסון להיפגע ולהביא את האזור למוקד. כבה את לייזר ארגון ולהדליק לייזר שני הפוטון. סרוק את הדגימה עם שני הפוטונים בעצימות לייזר של שידור ~ 9% על מנת לוודא כי האקסון הוא עדיין בפוקוס.
5. לחץ על הכפתור "עצור", כך כלי החיתוך יהיה זמין. השתמש לחתוך כדי להתמקד על שטח של עניין. בדרך כלל אנחנו הזום ~ 70X (זום ניתן לבדוק תחת הלשונית "מצב"). תחת הלשונית "ערוצים" לשנות את העוצמה של שני הפוטונים מן השידור ~ 9% לשידור% 15-20.
6. כדי לנתק את האקסון להפעיל את "מהיר XY" כפתור 1 על השני ואז ללחוץ על כפתור לעצור כדי למנוע נזק מיותר. האקסון יש לראות פסולת מפוזרות אם ההליך עבד.
7. כדי להבטיח האקסוןנפגע לחזור 488 ננומטר ארגון לייזר, לקחת תמונה אחרת confocal, וליצור הקרנת מקסימלית.

חלק 4: הדמיה Confocal זמן לשגות על Zeiss LSM 510

1. היכונו הדמיה. אם אתה משתמש במה מחומם, כדי להיות בטוח להפעיל אותו לפחות 30 דקות לפני הקמת הסרט זמן לשגות שלך. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחד עם המטרה האוויר הרצוי. אנו משתמשים 20X, 0.5 אובייקטיבי NA. פתח Zeiss LSM 510 תוכנת הדמיה. הפעל את הלייזר מתאים להגדיר את התצורה הרצויה. נעבור עתה לתאר פרוטוקול מפורט עבור הדמיה לטווח ארוך עם תוכנת LSM Zeiss זמן רב. שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקרוסקופ שלך עם תוכנת הדמיה שלך.
2. הגדר את המיקום ואת התצורה של העובר הראשון שלך בחלון זמן רב. פתח את הסריקה, במה, חלונות זמן רב. הפעל סריקה מהירה על חלון הסריקה. הזז את הבמה למצב XY הרצוי. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. אם אתה רק הדמיה one העובר, לחץ על הכרטיסייה "בית גיל" בחלון זמן רב. לחץ על "החלף XYZ" ואז על "שמור הגדרות". מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. המשיכו לשלב 4.4. אם יש לך במה ממוכן, באפשרותך להגדיר מיקומים מרובים עוברים מספר תמונות. במקרה זה, אתה צריך לבחור את "מיקומים" הכרטיסייה לפני הגדרת XYZ ותצורה עבור המיקום הראשון שלך. כמו כן, הקפד כי התפריט הנפתח מתחת הכרטיסייה "מיקומים" הוא על מיקום 1, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר רב loc 1, לפני שאתה לוחץ על שמירת התצורה.
3. הגדר את המיקום ואת התצורה של העוברים הנותרים שלך בחלון זמן רב. אתר העובר הבא שלך, ולאחר מכן לחץ על סריקה מהירה, להזיז את הבמה למצב XY הרצוי, סימן עמדות הראשונה והאחרונה שלך Z בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. לחץ על "החלף XYZ". בדוק את התפריט הנפתח ממש מתחת ללשונית "מיקומים" הוא על מיקום 2, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר loc רב 2, ואז ללחוץ על "שמור הגדרות". מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. חזור על תהליך זה עבור העוברים הנותרים.
4. הגדרת פרמטרים לרכישת התמונה בחלון Loc רב. בחר את האפשרות GR-GL בסעיף "רשימה של בלוקים", ולאחר מכן להזין את מספר החזרות הרצוי של הקבוצה. זהו מספר הפעמים confocal תרכוש תמונה במיקום זה. הזן את המרווח הרצוי לחכות בסעיף פרמטרים. זהו משך הזמן מתחילת החזרה one הדמיה כדי להתחיל את החזרה הבאה. בחר "ZStackXY" בסעיף תצורה. הזן את שם הקובץ בסיס בחלק התחתון. לחץ על "DB בחר תמונה" ובחר mdb שלך. לחץ על כפתור "אפשרויות". בחר בתיקיית mdb שלך להציל את הקבצים הזמניים. בדוק "לשמור על התמונה הסופית פתוח", "להציל את התמונה הסופית", ו "באמצע הערימה z". בחר להמתין מרווח. לחץ על אישור כדי לסגור את חלון אפשרויות. לחץ על "הזמן להתחיל". השאירו חלון פתוח זמן רב למשך של הדמיה.
5. ניתוח הנתונים. כאשר זמן לשגות הדמיה סיימה, את התוכנה זמן רב ירכז את כל הקבצים הזמניים שלך לתוך קובץ סיכום עבור כל מיקום. אם אתם רוצים לעצור את הסרט לפני שהוא מלא, הקפד ללחוץ על "סיום" במקום "עצור", כך קובץ סיכום תיווצר. קבצים זמניים וקבצי סיכום צריך להיות נשמר אוטומטית לתיקיה mdb המיועד. מתפריט התוכנה LSM, לחץ על "צפה 3D", ואז "הטלה". עם קובץ סיכום שלך שנבחרה בתפריט הנפתח, לחץ על "החל". זה יפיק תחזיות מרבי של מחסנית Z עבור כל תמונה confocal. בתפריט התוכנה LSM, לחצו על "קובץ", ולאחר מכן "ייצוא". שמור את תחזיות המרבי כסדרה של קבצי tif. לאחר מכן תוכל ליצור סרט מתוך סדרה של קבצי tif באמצעות ImageJ או QuickTime Pro. אקסונים בתמונות LSM ניתן לייחס בשלושה ממדים באמצעות ניתוח התמונה בתוכנה (למשל NeuroLucida מ MicroBrightfield) כדי להפיק מידע כמותי מפורט על מורפולוגיה האקסון.

חלק 5: תוצאות נציג

ניסוי מוצלח יביא ייצוג מדויק של הדינמיקה הסלולרים של החלמה מפציעה האקסון. עוברים שלך יהיה בריא לאחר הדמיה, עם ניוון לא גלוי דופק חזק. Axotomy אמור לגרום נזק מדויק, רק ניתוק ענף מוגדר של האקסון. לא צריך להיות שום פגיעה אקסונים שמסביב מוות של תאים מינימלי. אנו מאמינים כי אנו רואים את מותו של תא אפידרמיס בודד ישירות על האתר axotomy של 50% ~ של ניסויים. אם אתה מבחין יותר נזק, אתה צריך לייעל את פרוטוקול שני הפוטונים שלך כמתואר בדיון.

Discussion

השתמשנו בשיטות המתוארות במדויק axotomize אקסונים חושית הפריפריה ישירות לקיים התחדשות בעובר חי דג הזברה. ארוך טווח זמן לשגות הדמיה confocal של דג הזברה יכול לשמש כדי לצפות תהליכים התפתחותיים רבים in vivo. הליך שני הפוטונים axotomy המתואר יכול להיות שונה עבור מטרות רבות ניסויים שונים. השתמשנו הנוהל הכללי אותו לכרות trigeminal כל חושי הגוף תא עצב, על ידי התקרבות על גוף התא, ולא על ענף של האקסון היקפי. כל סוג תא מזוהה עם הקרינה עלולים להינזק או דווקא ablated עם כוח ממוקד של הלייזר femtosecond. היינו השראה מושלמת בטכניקות אלה עבור מערכת דג הזברה על ידי מחקרים קודמים במערכות אחרות שבהם פעמו לייזרים שימשו כדי ליצור נזק מקומי או לכרות תאים ^4,5,6. בניסויים לשלוט אנחנו אישר כי axotomy הוא מדויק מאוד: אנחנו אף פעם לא פגעו האקסונים בסביבה, גם כאשר הם ענפי באותו תא, נפגע רק לעתים לתאי האפיתל בסמיכות קרובה אקסונים. סגוליות זו יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה כי בעוצמה של עירור ושתיים פוטון לייזר נושר quadratically עם המרחק מנקודת המוקד ^3,7. יתר על כן, מאז האנרגיה הנפלטת fluorophore נרגש תורם נזקי, תאים ללא תווית שמסביב עשויים להינצל.

כוח לייזר נדרש נזק האקסון עשוי להשתנות בהתאם להגדרת מעלה של הלייזר, את העומק של הרקמה, והמטרה הניסוי שלך. אם ברצונך נזק אקסונים עמוק העובר, יותר כוח יידרש. עדיף ניסיון axotomy בהספק נמוך, ואז בהדרגה להגדיל את הכוח, עד שתמצא את הסכום ינתק את האקסון. ברגע שיש לך נקבע את הכמות המתאימה של כוח לייזר axotomy, אתה אמור להיות מסוגל להשתמש בסמכות זו reproducibly לייזר לגרום נזק לרקמות המקומית. אם אתה מבחין כי כוח לאורך זמן יותר נדרש כדי ליצור axotomy, לייזר ו - מיקרוסקופ עשויה לדרוש תחזוקה (למשל, הלייזר עשוי להיות מתוך יישור). ודא לייזר מיושרת כראוי, נקי המטרה שלך, לבדוק את המראות.