Summary
यहाँ हम दीर्घकालिक इमेजिंग, दो photon इमेजिंग और ऊतक नुकसान तकनीक, और समय चूक confocal इमेजिंग के लिए zebrafish भ्रूण के बढ़ते के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
Zebrafish लंबे समय के लिए रहने वाले पारदर्शी भ्रूण के समय चूक इमेजिंग द्वारा विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन उपयोग किया गया है. यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए zebrafish भ्रूण माउंट और प्रदर्शन कैसे को स्वचालित करने के लिए समय चूक एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवियों का कब्जा. हम भी एक नियंत्रित, zebrafish में परिधीय संवेदी axons एक दो photon माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार एक femtosecond लेजर के ध्यान केंद्रित शक्ति का उपयोग कर के अलग - अलग शाखाओं को सटीक क्षति बनाने की विधि का वर्णन. सफल axotomy दो photon के लिए पैरामीटर प्रत्येक माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. हम दोनों एक कस्टम बनाया दो photon माइक्रोस्कोप और एक Zeiss 510 confocal दो photon / दो उदाहरण प्रदान करने पर दो photon axotomy प्रदर्शन करेंगे.
Zebrafish त्रिपृष्ठी संवेदी न्यूरॉन्स एक ट्रांसजेनिक लाइन व्यक्त संवेदी न्यूरॉन एक विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित GFP में visualized किया जा सकता है . हम इस zebrafish त्रिपृष्ठी मॉडल अनुकूलित करने के लिए सीधे zebrafish भ्रूण में रहने वाले संवेदी अक्षतंतु पुनर्जनन निरीक्षण. भ्रूण tricaine साथ anesthetized हैं और agarose की एक बूंद के भीतर तैनात रूप में यह solidifies. Immobilized भ्रूण के रूप में एक इमेजिंग phenylthiourea Ringers (PTU) के साथ भरा कक्ष के भीतर सील कर रहे हैं. हमने पाया है कि भ्रूण को लगातार 12-48 घंटे के लिए किया जा सकता है इन कक्षों में imaged. एक एकल छवि confocal तो axotomy के वांछित साइट का निर्धारण करने के लिए कब्जा कर लिया है. ब्याज की क्षेत्र में कम, गैर हानिकारक शक्ति के तहत संवेदी axons इमेजिंग द्वारा दो photon माइक्रोस्कोप पर स्थित है. Axotomy के वांछित साइट पर में zooming के बाद, बिजली और बढ़ जाता है और कि परिभाषित क्षेत्र के एक एकल स्कैन अक्षतंतु तोड़ करने के लिए पर्याप्त है. एकाधिक स्थान इमेजिंग समय चूक तो एक confocal खुर्दबीन पर सीधे चोट से axonal वसूली का पालन है.
Protocol
भाग 1: लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए बढ़ते zebrafish भ्रूण
- Embedding के लिए 1% कम पिघल agarose समाधान तैयार करें. डि पानी में एक छोटे से ट्यूब और एक हीटिंग ब्लॉक में 42 डिग्री सेल्सियस पर दुकान में माइक्रोवेव विभाज्य में हीटिंग agarose भंग.
- इमेजिंग के लिए भ्रूण का चयन करें और धीरे संदंश के साथ chorion अलावा खींच कर अपने chorions हटायें. भ्रूण 22-24 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF) पर एक 5% PTU Ringers समाधान में रखा जा सकता है है वर्णक के गठन को बाधित. इस इमेजिंग की स्पष्टता में सुधार और संवेदी axons की दो photon axotomies प्रदर्शन के लिए आवश्यक है. यदि प्राकृतिक रंगद्रव्य फार्म करने की अनुमति दी है, autofluorescence दो फोटोन खुर्दबीन पर axons obscures. Ringers zebrafish समाधान के लिए 116 मिमी NaCl, 2.9 मिमी KCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, और 5mm HEPES, पीएच 7.2 शामिल है .
- PTU Ringers ~ 0.02% tricaine जोड़कर भ्रूण anesthetize. यकीन है कि जानवरों के लिए आगे बढ़ने से पहले संपर्क करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं.
- एक गिलास या Teflon की अंगूठी के एक तरफ करने के लिए वैक्यूम तेल लागू करने और इसे एक गिलास को कवर पर्ची पर फिक्सिंग दीर्घकालिक इमेजिंग चैम्बर तैयार.
- 42 डिग्री agarose समाधान में एक गिलास pipet के साथ एक भ्रूण स्थानांतरण ख्याल रख रही PTU Ringers ज्यादा स्थानांतरण नहीं, तो agarose की एक बूंद के साथ तैयार कवर पर्ची पर भ्रूण स्थानांतरण.
- स्थिति भ्रूण के रूप में वांछित के रूप में agarose और मज़बूत बनाता है. ध्यान रखें कि इमेजिंग कक्ष जब आप कर रहे हैं रूप से फ़्लिप किया जाएगा ताकि कवर पर्ची ऊपर की सतह जाएगा.
- यदि आप एक motorized मंच है और एक ही बार में कई स्थानों छवि कर सकते हैं, दोहराने चरण प्रत्येक भ्रूण के लिए 1.4-1.6.
- Agarose पूरी तरह से जमना करने के लिए अनुमति दें, तो 0.02% tricaine PTU Ringers के साथ अंगूठी भरें.
- अंगूठी (ओं) के दूसरे पक्ष के लिए वैक्यूम तेल लागू करने के लिए, फिर एक गिलास स्लाइड के साथ अंगूठी (ओं) को कवर. पर सील कक्ष (ओं) फ्लिप. इन कक्षों सीधा या उलटा माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
भाग 2: दो photon गिरगिट तिवारी नीलम लेजर के साथ एक कस्टम निर्मित दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग axotomy
- इमेजिंग के लिए तैयार. खुर्दबीन के नीचे एक स्लाइड धारक पर घुड़सवार भ्रूण (ओं) रखें. एक 40x (0.8 एनए) पानी के उद्देश्य से एक भ्रूण पर ध्यान दें. लेजर पर मुड़ें. हम reproducibly कल्पना और निम्न पैरामीटर का उपयोग न्यूरॉन्स व्यक्त GFP नुकसान करने में सक्षम किया गया है. एक गैर हानिकारक सत्ता में axons कल्पना करने के लिए, की एक तरंग दैर्ध्य 910 नैनोमीटर (एनएम) और 30 के एक बिजली milliwatts (मेगावाट सूचीबद्ध नमूने पर सत्ता की राशि हैं) करने के लिए लेजर सेट. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें. हम ScanImage कैरेल SVOBODA प्रयोगशाला 2, 3 में विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
- ध्यान केंद्रित प्रेस के दो photon लेजर के साथ भ्रूण स्कैन करने के लिए, अक्षतंतु आप axotomize करना चाहते हैं का पता लगाने हैं, और इस अक्षतंतु की एक छवि पर कब्जा. पहली और आखिरी जेड पदों को मार्क करने के लिए, छवि अधिग्रहण, और जेड के ढेर की एक अधिकतम प्रक्षेपण.
- 70X में अक्षतंतु आप axotomize और स्कैनिंग रोक इच्छा की शाखा पर ज़ूम. 180 मेगावाट की हानिकारक शक्ति नमूना मेगावाट बढ़ाएँ, और लेजर के साथ एक एकल स्कैन प्रदर्शन. हम 1 करने के लिए जेड स्लाइस की संख्या की स्थापना और "पकड़ो" दबाने से इस करते हैं. यह अक्षतंतु तोड़ करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. अपने खुर्दबीन और प्रायोगिक लक्ष्य के लिए इस प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए तरीकों के लिए चर्चा देखें.
- बाहर ज़ूम, 30 मेगावाट बिजली की कम और एक छवि ले.
भाग 3: दो photon Zeiss पर axotomy 510 / दो photon confocal खुर्दबीन
- जगह मंच पर भ्रूण घुड़सवार और इसे ध्यान में लाने के एक 25x पानी उद्देश्य या अन्य उपयुक्त उद्देश्य का उपयोग.
- दो photon (910 एनएम) और आर्गन (488 एनएम) एक मल्टी ट्रैक सेटिंग में लेज़रों पर मुड़ें इतना है कि यह संभव है एक दूसरे से स्विच. हालांकि दोनों लेज़रों GFP का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, दो photon उत्सर्जन लाल के साथ कल्पना है, और हरे रंग के साथ argon लेजर उत्सर्जन दो अंतर करने के लिए.
- अक्षतंतु घायल की पहचान आर्गन लेजर का प्रयोग करें. जेड सेटिंग्स के अंतर्गत पहली और आखिरी ऑप्टिकल वर्गों निशान. एक confocal छवि ले लो और Z ढेर के एक अधिकतम प्रक्षेपण बनाने.
- घायल हो अक्षतंतु के क्षेत्र चुनें और ध्यान केंद्रित इस क्षेत्र में लाने. बंद आर्गन लेजर मुड़ें और दो photon लेजर पर बारी. ~ 9% संचरण के लिए सुनिश्चित करें कि अक्षतंतु ध्यान में अभी भी है एक लेजर की तीव्रता में दो photon के साथ नमूना स्कैन करें.
- इतना है कि फसल उपकरण उपलब्ध हो जाएगा "रोक" बटन पर क्लिक करें. फसल के हित के क्षेत्र पर में ज़ूम का उपयोग करें. आम तौर पर हम ~ 70X (ज़ूम "मोड" टैब के तहत जाँच की जा सकती है) के लिए ज़ूम. "चैनल" टैब के तहत ~ 9% 15-20% प्रसारण के लिए प्रसारण से दो photon की तीव्रता बदल जाते हैं.
- एक अक्षतंतु तोड़ के लिए के बारे में 1 दूसरी और फिर रोक बटन दबाएँ करने के लिए अधिक क्षति से बचने के लिए "तेजी XY" बटन को सक्रिय करें. अक्षतंतु बिखरे मलबे के रूप में देखा जाना चाहिए अगर प्रक्रिया काम किया.
- सुनिश्चित करें कि अक्षतंतु488 एनएम आर्गन लेजर करने के लिए वापस स्विच क्षतिग्रस्त हो गया था, एक और confocal छवि ले, और एक अधिकतम प्रक्षेपण बनाने.
भाग 4: Zeiss LSM 510 पर Confocal इमेजिंग समय चूक
- इमेजिंग के लिए तैयार. यदि आप एक गर्म चरण का उपयोग कर रहे हैं, अपनी फिल्म समय चूक की स्थापना से पहले कम से कम 30 मिनट पर यह बारी करने के लिए सुनिश्चित हो. खुर्दबीन के नीचे एक स्लाइड धारक पर घुड़सवार भ्रूण (ओं) रखें. वांछित हवा उद्देश्य के साथ एक भ्रूण पर ध्यान दें. हम एक 20X, 0.5 एनए उद्देश्य का उपयोग करें. ओपन Zeiss LSM 510 इमेजिंग सॉफ्टवेयर. उपयुक्त लेज़रों चालू करें और इच्छित विन्यास सेट. अब हम Zeiss LSM मल्टी समय सॉफ्टवेयर के साथ लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे. इन विधियों अपने इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ अपनी खुद की खुर्दबीन पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
- स्थिति और मल्टी समय विंडो में अपने पहले भ्रूण के विन्यास परिभाषित. स्कैन, मंच, और मल्टी समय खिड़कियां खोलें. तेजी से खिड़की स्कैन पर स्कैन सक्रिय. वांछित XY स्थिति के लिए मंच हटो. खिड़की स्कैन में पहली और आखिरी जेड पदों मार्क. रोक प्रेस, तो मिड खिड़की स्कैन में भी. बीच जेड खत्म टुकड़ा के स्कैन के लिए प्रतीक्षा करें, तो मंच विंडो में चिह्न स्थिति दबाएँ. यदि आप केवल इमेजिंग एक भ्रूण, मल्टी समय विंडो में "एकल स्थान" टैब पर क्लिक करें. "बदलें XYZ" पर क्लिक करें और फिर "विन्यास सहेजें". सहमत हूँ, जब पिछले विन्यास को अधिलेखित करने के लिए कहा. 4.4 कदम आगे बढ़ें. यदि आप एक यंत्रीकृत मंच है, आप छवि एकाधिक भ्रूण के लिए कई स्थानों सेट कर सकते हैं. इस मामले में, आप XYZ और अपना पहला स्थान के लिए विन्यास को परिभाषित करने से पहले "एकाधिक स्थान" टैब का चयन करना चाहिए. इसके अलावा, यकीन है कि बस "एकाधिक स्थान" टैब के नीचे पुल - डाउन मेनू 1 स्थान पर है, और विन्यास खंड में पुल - डाउन मेनू 1 नियंत्रण रेखा बहु कहते हैं, इससे पहले कि तुम पर विन्यास को बचाने क्लिक करें.
- और मल्टी समय खिड़की में अपनी शेष भ्रूण की स्थिति और विन्यास परिभाषित. अपने अगले भ्रूण का पता लगाएँ, तो तेजी से स्कैन दबाएँ, वांछित XY स्थिति में मंच ले जाएँ, और अपने खिड़की स्कैन में पहली और आखिरी जेड पदों निशान. रोक प्रेस, तो मिड खिड़की स्कैन में भी. बीच जेड खत्म टुकड़ा के स्कैन के लिए प्रतीक्षा करें, तो मंच विंडो में चिह्न स्थिति दबाएँ. "बदलें XYZ" पर क्लिक करें. जाँच करें कि बस "एकाधिक स्थान" टैब के नीचे पुल - डाउन मेनू 2 स्थान पर है, और है कि विन्यास खंड में पुल - डाउन मेनू बहु 2 नियंत्रण रेखा का कहना है, तो "विन्यास सहेजें" पर क्लिक करें. सहमत हूँ, जब पिछले विन्यास को अधिलेखित करने के लिए कहा. शेष भ्रूण के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- मल्टी नियंत्रण रेखा खिड़की में छवि अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट. "ब्लॉक की सूची" खंड में GR-जीएल विकल्प चुनें, और तब समूह repetitions के इच्छित संख्या दर्ज करें. इस बार की संख्या confocal प्रत्येक स्थान पर एक छवि प्राप्त होगा है. पैरामीटर्स अनुभाग में वांछित प्रतीक्षा अंतराल दर्ज करें. यह अगले पुनरावृत्ति की एक इमेजिंग पुनरावृत्ति की शुरू से शुरू करने के लिए समय की राशि है. विन्यास खंड में "ZStackXY" का चयन करें. आप नीचे खंड में आधार फ़ाइल नाम दर्ज करें. "का चयन करें छवि DB" पर क्लिक करें और अपने mdb चुनें. "विकल्प" बटन पर क्लिक करें. अस्थायी फ़ाइलों को बचाने के अपने mdb फ़ोल्डर का चयन करें. जाँच करें, "अंतिम छवि को खुला रखने के" "अंतिम छवि को बचाने के", और "z ढेर के बीच". अंतराल इंतजार का चयन करें. ठीक क्लिक करें विकल्प विंडो बंद. "शुरू समय" पर क्लिक करें. मल्टी समय विंडो इमेजिंग की अवधि के लिए खुला छोड़ दो.
- अपने डेटा का विश्लेषण. जब समय चूक इमेजिंग समाप्त हो गया है, मल्टी समय सॉफ्टवेयर प्रत्येक स्थान के लिए एक सारांश फ़ाइल में अपने अस्थायी फ़ाइलों के सभी संकलन होगा. यदि आप फिल्म को रोकने से पहले यह पूरा हो गया है चाहते हैं, करने के लिए "समाप्त करें" "बंद करो" के बजाय, प्रेस इतना है कि एक सारांश फ़ाइल बनाया जाएगा सुनिश्चित करें. अस्थायी फ़ाइलें और सारांश फ़ाइलें स्वचालित रूप से नामित. mdb फ़ोल्डर को बचाया जाना चाहिए. LSM सॉफ्टवेयर मेनू से, "3D दृश्य पर क्लिक करें, फिर" प्रोजेक्शन ". अपने सारांश पुल - डाउन मेनू में चयनित फ़ाइल के साथ, "लागू करें" पर क्लिक करें. यह प्रत्येक confocal छवि के लिए जेड ढेर की अधिकतम अनुमानों उत्पन्न होगा. LSM सॉफ्टवेयर मेनू पर, "फाइल" पर क्लिक करें, फिर "निर्यात". Tif फ़ाइलों की एक श्रृंखला के रूप में अधिकतम अनुमानों सहेजें. तुम तो tif फ़ाइलें ImageJ या QuickTime प्रो का उपयोग की श्रृंखला के बाहर एक फिल्म बना सकते हैं. LSM छवियों में axons अक्षतंतु आकारिकी के बारे में विस्तृत मात्रात्मक जानकारी उत्पन्न छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (MicroBrightfield से जैसे NeuroLucida) का उपयोग करने के लिए तीन आयामों में पता लगाया जा सकता है.
भाग 5: प्रतिनिधि के परिणाम
एक सफल प्रयोग सेलुलर गतिशील का सही प्रतिनिधित्व में परिणाम होगाचोट से अक्षतंतु वसूली की है. आपके भ्रूण इमेजिंग के बाद स्वस्थ नहीं दिखाई अध: पतन और एक मजबूत दिल की धड़कन के साथ किया जाएगा. axotomy सटीक नुकसान में परिणाम केवल अक्षतंतु के परिभाषित शाखा विच्छेद चाहिए. आसपास के axons और कम से कम कोशिका मृत्यु को कोई चोट नहीं होना चाहिए. हमें विश्वास है कि हम सीधे ~ प्रयोगों के 50% में axotomy की साइट पर एक एकल epidermal सेल की मौत देख. यदि आप और अधिक नुकसान का निरीक्षण करने के लिए, आप अपने दो photon प्रोटोकॉल का अनुकूलन के रूप में चर्चा में वर्णित करना चाहिए.
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Discussion
हम ठीक परिधीय संवेदी axons axotomize और रहने वाले zebrafish भ्रूण में सीधे उत्थान निरीक्षण वर्णित तरीकों का इस्तेमाल किया है. लंबी अवधि के समय चूक zebrafish में confocal इमेजिंग vivo में कई विकास की प्रक्रिया का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. axotomy दो photon वर्णित प्रक्रिया कई अलग अलग प्रयोगात्मक लक्ष्यों के लिए संशोधित किया जा सकता है. हम एक ही सामान्य प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है पूरे त्रिपृष्ठी संवेदी न्यूरॉन सेल शरीर ablate सेल शरीर पर बजाय परिधीय अक्षतंतु की एक शाखा पर में zooming द्वारा. प्रतिदीप्ति के साथ कोई सेल से पहचाने जाने योग्य प्रकार ठीक हो सकता है या क्षतिग्रस्त हो सकता है femtosecond लेजर के ध्यान केंद्रित शक्ति के साथ ablated. हम कई अन्य प्रणालियों जहां स्पंदित पराबैंगनीकिरण स्थानीयकृत क्षति बनाने या 4,5,6 कोशिकाओं ablate इस्तेमाल किया गया में पिछले अध्ययनों द्वारा zebrafish प्रणाली के लिए इन तकनीकों का सही करने के लिए प्रेरित थे. हम नियंत्रण प्रयोगों में पुष्टि की है कि axotomy बेहद सटीक है: हम कभी नहीं पास axons क्षतिग्रस्त है, तब भी जब वे एक ही कक्ष की शाखाओं हैं, और कभी कभी ही axons के करीब निकटता में उपकला कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त. यह विशिष्टता तथ्य यह है कि दो photon लेजर उत्तेजना से तीव्रता से फोकल 3,7 बिंदु से दूरी के साथ quadratically बूँदें द्वारा समझाया जा सकता है. इसके अलावा, के बाद से उत्साहित fluorophore से उत्सर्जित ऊर्जा photodamage के लिए योगदान देता है, आसपास के unlabeled कोशिकाओं को बख्शा होने की संभावना हैं.
लेजर के लिए एक अक्षतंतु क्षति के लिए आवश्यक शक्ति लेजर, ऊतक की गहराई, और अपने प्रायोगिक लक्ष्य के सेट पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं. यदि आप axons भ्रूण में गहरी क्षति चाहते हैं, और अधिक शक्ति की आवश्यकता होगी. यह सबसे अच्छा है एक कम शक्ति पर axotomy करने का प्रयास, और फिर संवर्द्धित शक्ति में वृद्धि जब तक आप राशि है कि अक्षतंतु तोड़ जाएगा मिल. एक बार जब आप axotomy के लिए लेजर बिजली की उचित राशि निर्धारित किया है, आप reproducibly इस लेसर शक्ति का उपयोग करने के लिए स्थानीय ऊतकों को नुकसान का कारण करने में सक्षम होना चाहिए. अगर तुम नोटिस कि अधिक से अधिक समय सत्ता में एक axotomy बनाने के लिए आवश्यक है, लेजर और माइक्रोस्कोप रखरखाव की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, लेजर संरेखण के बाहर किया जा सकता है) हो सकता है. सुनिश्चित करें कि आपका लेजर ठीक से गठबंधन किया है, अपने उद्देश्य साफ है, और दर्पण की जांच.
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Acknowledgments
हम प्रारंभिक सलाह के लिए एक दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए स्थानीय ऊतकों को नुकसान, समय चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते पर सलाह के लिए कैथी Joubin, और विचार विमर्श के लिए Sagasti और Portera - Cailliau प्रयोगशालाओं बनाने पर मार्क Terasaki धन्यवाद. प्रारंभिक प्रयोगों के द्वारा वुड्स होल, एमए में समुद्री जैव लेबोरेटरीज में एक घास फाउंडेशन फैलो के रूप में के रूप में प्रदर्शन किया गया. Sagasti प्रयोगशाला में काम व्हाइटहॉल फाउंडेशन, Klingenstein फाउंडेशन, और एक बायोलॉजिकल साइंसेज में Burroughs Wellcome कोष कैरियर पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
