Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Summary

Здесь мы опишем метод для монтажа данио эмбрионов для долгосрочных изображений, двухфотонного изображений и тканей повреждения техники и покадровой конфокальной микроскопии.

Abstract

Данио рерио уже давно используются для исследования клеточных и молекулярных механизмов развития путем покадровой визуализации живых прозрачных эмбриона. Здесь мы опишем метод для монтирования данио эмбрионов для долгосрочных изображений и продемонстрировать, как автоматизировать захват покадровой изображения с помощью конфокальной микроскопии. Мы также опишем метод для создания контролируемой, точный ущерб отдельным отраслям периферических сенсорных аксонов в данио использованием сосредоточены мощности фемтосекундного лазера установлены на двухфотонного микроскопа. Параметры для успешного двухфотонного axotomy должны быть оптимизированы для каждого микроскопа. Мы продемонстрируем двухфотонного axotomy с обеих индивидуальному заказу двухфотонного микроскопа и Zeiss 510 конфокальной / двухфотонного предоставить два примера.

Данио рерио тройничного сенсорных нейронов могут быть визуализированы в трансгенной линии выражения GFP обусловлен сенсорного нейрона конкретных промоутер ^1. Мы адаптировали эту данио тройничного модель непосредственно наблюдать сенсорной регенерации аксонов в живых рыбок данио эмбрионов. Эмбрионы анестезировали tricaine и расположены в пределах капли агарозы как он затвердевает. Иммобилизованные эмбрионы запечатан в визуализации камере, наполненной фенилтиомочевиной (ПТУ) Ringers. Мы обнаружили, что эмбрионы могут быть постоянно отображается в этих камерах для 12-48 часов. Одного конфокальной изображение затем захватили, чтобы определить желаемый сайт axotomy. Интересующей нас области находится на двухфотонного микроскопа изображений сенсорных аксонов при низких, не причинен ущерб власти. После увеличения в желаемый сайт axotomy, сила увеличивается, и одно сканирование, как определено региона достаточно, чтобы разорвать аксона. Несколько месте покадровой визуализации затем устанавливается на конфокальной микроскопии непосредственно наблюдать аксонального восстановления после травмы.

Protocol

Часть 1: Монтаж данио эмбрионов для долгосрочных изображений

1. Подготовка 1% агарозном низкой расплава решение для вложения. Растворите в воде агарозном DI при нагревании в микроволновой печи, аликвоту в трубочки и хранить в нагревательный блок на 42 градусов по Цельсию.
2. Выберите эмбрионов для работы с изображениями и удалить их chorions, осторожно потянув хориона кроме щипцами. Эмбрионы могут быть помещены в 5% раствор ПТУ Звонки на 22-24 часа после оплодотворения (ФВЧ), чтобы препятствовать образованию пигмента. Это повышает четкость изображения и имеет важное значение для выполнения двухфотонного axotomies сенсорных аксонов. Если натуральный пигмент имеет право форме, аутофлюоресценция скрывает аксонов на двухфотонного микроскопа. Ringers решение для рыбок данио содержит 116 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl ₂ и 5 мМ HEPES, рН 7,2.
3. Обезболить эмбрионов, добавив ~ 0,02% tricaine для ПТУ Ringers. Убедитесь, что животные не реагирует на касания прежде чем продолжить.
4. Подготовка долгосрочных изображения камеры с применением вакуумной смазкой на одной стороне кольца стекла или тефлона и фиксации его на скольжение покровного стекла.
5. Передача одного эмбриона в 42 градуса решение агарозы со стеклянной пипетки, заботясь не передавать большую часть ПТУ Ringers, а затем перенести эмбрион с одной капли агарозы на подготовленные скольжения покрытия.
6. Позиция эмбриона в соответствии с пожеланиями, как агароза затвердеет. Имейте в виду, что камеры изображений будет перевернут, когда вы сделали так, чтобы покровное стекло будет верхней поверхности.
7. Если у вас есть моторизованные стадии и могут изображение нескольких местах сразу, повторите шаги 1.4-1.6 для каждого эмбриона.
8. Разрешить агарозы, чтобы полностью укрепить, а затем заполнить кольцо с 0,02% tricaine ПТУ Ringers.
9. Применение вакуумной смазки на другой стороне кольца (ы), затем накройте кольцо (ы) с стекло. Флип герметичную камеру (ы) закончилась. Эти камеры могут быть использованы для работы с изображениями на вертикальном или перевернутом микроскопов.

Часть 2: Двухфотонное axotomy помощью пользовательского построен двухфотонного микроскопа с Chameleon Ti-Sapphire лазер

1. Подготовка к визуализации. Место установлен эмбриона (ов) на держатель слайдов под микроскопом. Сосредоточьтесь на один эмбрион с 40Х (0,8 NA) вода цели. Включите лазер. Мы были в состоянии воспроизводимо визуализировать и повреждения нейронов GFP выражения, используя следующие параметры. Для визуализации аксонов в не причинен ущерб власти, установить лазер на длине волны 910 нанометров (нм) и мощностью 30 милливатт (мВт перечисленные количество энергии в образце). Откройте для обработки изображений. Мы используем ScanImage Программное обеспечение, разработанное в лаборатории Карела Свободы ^{2, 3.}
2. Пресс фокус сканирования эмбриона с двухфотонного лазера, местонахождение аксонов вы хотите axotomize, а также захватить картинку из этого аксона. Марка первого и последнего Z позиции, приобретать изображения, и сделать максимальный выступ стеки Z.
3. Увеличить 70X на ветви аксона вы хотите axotomize и остановки сканирования. Увеличение мВт на образец повреждения мощностью 180 мВт, а также выполнять одно сканирование с лазером. Мы делаем это, установив число срезов Z 1 и нажать "Grab". Это должно быть достаточным, чтобы разорвать аксона. См. обсуждение методов оптимизации этой процедуры для вашего микроскопа и экспериментальные цели.
4. Уменьшение, снижение мощности до 30 мВт и принимать изображения.

Часть 3: Двухфотонное axotomy на Zeiss 510 конфокальной / двухфотонного микроскопа

1. Место установлен эмбриона на сцену и привести его в фокусе использованием 25X цели воду или другую подходящую цель.
2. Включите двухфотонного (910 нм) и аргона (488 нм) лазеров в многодорожечной настройки, так что можно переключиться с одного на другой. Хотя оба эти лазеры используются для обнаружения GFP, двухфотонного излучения визуализируется с красными, и излучение аргонового лазера с зеленым различать два.
3. Использование аргона лазерным определить аксон травмировать. Под маркой Z параметры первого и последнего оптических срезов. Возьмите конфокальной изображения и создать максимальный выступ стек Z.
4. Выбрать регион аксона быть ранены и довести этот регион в фокусе. Выключите Аргон лазера и включите двухфотонного лазера. Сканирования образца с двухфотонного по интенсивности лазерного излучения составляет ~ 9% передач, чтобы убедиться, что аксон-прежнему находится в фокусе.
5. Нажмите кнопку "стоп", так что инструмент кадрирования будут доступны. Использование культур, чтобы увеличить сферу интересов. Обычно мы зум до ~ 70X (зум может быть проверено в "режиме" вкладка). Под "каналов" на вкладке изменить интенсивность двухфотонного от ~ 9% передачи до 15-20% передач.
6. Чтобы разорвать аксон активировать «быстрый XY" кнопку в течение 1 секунды, а затем нажмите кнопку остановки, чтобы избежать избыточного повреждения. Аксон следует рассматривать как рассеянные обломки, если процедура работает.
7. Чтобы убедиться, что аксонбыл поврежден переключиться обратно на 488 нм аргонового лазера, сделать еще один конфокальной изображения и создавать максимальные проекции.

Часть 4: конфокальной покадровой визуализации на Zeiss LSM 510

1. Подготовка к визуализации. Если вы используете нагревательный столик, не забудьте включить его, по крайней мере за 30 минут до настройке покадровой фильма. Место установлен эмбриона (ов) на держатель слайдов под микроскопом. Сосредоточьтесь на один эмбрион с желаемыми воздуха цели. Мы используем 20х, 0,5 Н. А. цели. Открытое Zeiss LSM 510 обработки изображений. Включить соответствующие лазеров и созданы нужной конфигурации. Опишем теперь подробный протокол для долгосрочных изображений с Zeiss LSM многопользовательская программного обеспечения Time. Эти методы могут быть адаптированы для использования на Вашем собственном микроскоп с вашей обработки изображений.
2. Определить положение и конфигурация вашего первого эмбриона в многофункциональном окне Time. Открытое сканирования, сцена, и мульти времени Windows. Активировать быстрое сканирование в окне сканирования. Перемещение на сцену, чтобы желаемое XY позиции. Марка первого и последнего Z позиции в окно сканирования. Пресс остановить, то Mid, и в окно проверки. Дождитесь окончания сканирования фрагмента средней Z до конца, а затем нажмите знак позиции в стадии окна. Если вы только изображения одного эмбриона, нажмите на "одном месте" на вкладке в мульти окна времени. Нажмите на "Заменить XYZ" и затем на "Сохранить конфигурацию". Согласитесь, когда их просят переписать предыдущей конфигурации. Переходите к пункту 4.4. Если у вас есть механизированной этапе, вы можете создать несколько мест, чтобы изображение несколько эмбрионов. В этом случае, Вы должны выбрать "разных местах" вкладки перед определением XYZ и конфигурации для вашего первого места. Кроме того, убедитесь, что выпадающее меню чуть ниже "разных местах" закладка на месте 1, и что выпадающее меню в разделе конфигурации говорит много ос 1, прежде чем нажать кнопку Сохранить настройки.
3. Определить положение и конфигурацию вашего оставшиеся эмбрионы в многофункциональном окне Time. Найдите следующий эмбриона, а затем быстрое сканирование, перемещать сцены в положение желаемой XY, и отметить свой первый и последний Z позиции в окно проверки. Пресс остановить, то Mid, и в окно проверки. Дождитесь окончания сканирования фрагмента средней Z до конца, а затем нажмите знак позиции в стадии окна. Нажмите на "Заменить XYZ". Убедитесь, что выпадающее меню чуть ниже "разных местах" закладка на месте 2, и что выпадающее меню в разделе конфигурации говорит много ос 2, затем нажмите кнопку "Сохранить настройки". Согласитесь, когда их просят переписать предыдущей конфигурации. Повторите этот процесс для оставшихся эмбрионов.
4. Настройка параметров для получения изображения в мульти Loc окна. Выберите GR-GL опцию в "Список блоков" раздел, а затем введите нужное число повторений группы. Это количество раз конфокальной приобретет имидж в каждом месте. Введите нужный интервал ожидания в разделе Параметры. Это количество времени от начала одного изображения повторения в начале следующего повторения. Выберите "ZStackXY" в разделе конфигурации. Введите свой базовое имя файла в нижней части. Нажмите на кнопку "Выбрать Изображение БД" и выбрать MDB. Нажмите на кнопку "Параметры". Выберите MDB папку для сохранения временных файлов. Установите флажок "сохранить финальное изображение открытой", "сохранить окончательное изображение», и «середины стека Z". Выберите ждать интервал. Нажмите кнопку ОК, чтобы закрыть окно настроек. Нажмите на "Время начала". Оставьте многопользовательская окно Время открытой для продолжительности визуализации.
5. Проанализируйте свои данные. При замедленной изображения завершена, мульти программного обеспечения Время соберет все свои временные файлы в итоговый файл для каждого места. Если вы хотите, чтобы остановить фильм до его завершения, не забудьте нажать кнопку "Готово" вместо "Стоп", так что итоговый файл будет создан. Временные файлы и итоговые файлы будут автоматически сохранены в указанной папке MDB. В меню программного обеспечения LSM, нажмите кнопку "3D View", затем "Проекция". С вашего резюме файла, выбранного в выпадающем меню, нажмите кнопку "Применить". Это создаст максимальные проекции стек Z для каждого конфокального изображения. В меню программного обеспечения LSM, кликните на "Файл", затем "Экспорт". Сохранить максимальной проекции в виде серии TIF ​​файлов. Вы можете создать фильм из серии TIF ​​файлов с помощью ImageJ или QuickTime Pro. Аксоны в LSM образы можно проследить в трех измерениях, используя анализ изображения программное обеспечение (например NeuroLucida от MicroBrightfield) для получения детальной количественной информации о аксон морфологии.

Часть 5: Представитель результаты

Успешный эксперимент приведет к точным представлением сотовой динамическихс аксона восстановления после травмы. Ваши эмбрионы будут здоровыми после съемки, без видимых дегенерации и сильным сердцебиением. Axotomy должно привести к повреждению точным, только разрыв определена ветвь аксона. Там должно быть никакого вреда окружающим аксонов и минимальной клеточной смерти. Мы считаем, что мы видим смерть одного эпидермальный ячейке, расположенной непосредственно над местом axotomy в ~ 50% от экспериментов. Если вы наблюдаете больше вреда, Вы должны оптимизировать ваш двухфотонного Протокол, как описывалось в обсуждении.

Discussion

Мы использовали методы, описанные точно axotomize периферических сенсорных аксонов и непосредственно наблюдать регенерации в эмбрион полосатого данио жизни. Долгосрочные покадровой конфокальной микроскопии в данио рерио могут быть использованы для наблюдения многих процессов развития в естественных условиях. Двухфотонного axotomy процедуре, описанной может быть изменен для различных экспериментальных целей. Мы использовали те же самые общие процедуры, чтобы удалять все тройничного сенсорных органов клетка нейрона, путем увеличения масштаба на теле клетки, а не на ветке периферического аксона. Любой тип клеток можно отождествить с флуоресценции может быть точно повреждены или удаленной с сосредоточена сила фемтосекундного лазера. Мы были вдохновлены, чтобы усовершенствовать эти методы для рыбок данио системы предыдущих исследований, в некоторых других системах, где импульсных лазеров были использованы для создания локализованного ущерба или удалять клетки ^4,5,6. В контрольных экспериментах мы подтвердили, что axotomy очень точным: мы никогда не поврежденных аксонов рядом, даже если они являются филиалами одной камере, и лишь изредка поврежденных эпителиальных клеток в тесном сопоставлении с аксонов. Эта специфика может быть объяснена тем фактом, что интенсивность от двухфотонного лазерного возбуждения падает квадратично с расстоянием от точки фокуса ^3,7. Более того, поскольку энергия, излучаемая из возбужденного флуорофора способствует фотостарения, окружающих немеченого клетки, вероятно, будут спасены.

Лазерной мощности, достаточной для повреждения аксонов могут варьироваться в зависимости от набора из лазера, глубину ткани, а ваши экспериментальные цели. Если вы хотите повреждение аксонов глубже в зародыше, больше власти будет требоваться. Лучше всего попытаться axotomy на малой мощности, а затем постепенно увеличивать силу, пока не найдете сумму, которая будет разорвать аксона. Как только Вы определили соответствующую сумму мощности лазера для axotomy, вы должны быть в состоянии использовать это воспроизводимо мощности лазерного излучения вызывают местное повреждение тканей. Если вы заметили, что со временем больше энергии требуется для создания axotomy, лазерных и микроскоп может потребоваться техническое обслуживание (например, лазер может быть из выравнивания). Убедитесь, что ваш лазер правильно выровнен, чистый ваша цель, и проверить зеркал.