De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Summary

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

Abstract

Pez cebra han sido utilizados para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo de time-lapse del embrión transparente de vida. Aquí se describe un método para montar embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes y se muestra cómo automatizar la captura de imágenes con lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal. También describe un método para crear daño controlado y preciso a las distintas ramas de los axones sensoriales periféricas en el pez cebra con el poder concentrado de un láser de femtosegundo montada en un microscopio de dos fotones. Los parámetros para el éxito de dos fotones axotomía debe ser optimizado para cada microscopio. Vamos a demostrar de dos fotones axotomía en tanto a la medida de dos fotones microscopio Zeiss y un 510 / confocal de dos fotones que son dos ejemplos.

Pez cebra neuronas sensoriales del trigémino se pueden visualizar en una línea transgénica que expresa GFP dirigida por un promotor neuronas sensoriales específicas ^1. Hemos adaptado este modelo de pez cebra trigémino de observar directamente la regeneración de axones sensoriales en vida embriones de pez cebra. Los embriones son anestesiados con tricaína y colocado dentro de una gota de agarosa al solidificarse. Embriones inmovilizados están sellados dentro de una cámara de imágenes llenas de feniltiourea (PTU) Timbres. Hemos encontrado que los embriones pueden ser continuamente imágenes de estas cámaras durante 12-48 horas. Una imagen confocal solo es capturado para determinar el sitio deseado de axotomía. La región de interés se encuentra en el microscopio de dos fotones de imágenes de los axones sensoriales en baja, no dañar el poder. Después de hacer zoom sobre el sitio deseado de axotomía, el poder es mayor y una sola exploración de esa región definida es suficiente para romper el axón. Ubicación de múltiples imágenes a intervalos de tiempo-luego se estableció en un microscopio confocal de observar directamente la recuperación de una lesión axonal.

Protocol

Parte 1: Montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes

1. Prepare un 1% de baja fusión solución de agarosa para incrustar. Disolver la agarosa en agua desionizada, calentando en el microondas, alícuotas en tubos pequeños y almacenar en un bloque de calentamiento a 42 grados centígrados.
2. Seleccionar embriones para la imagen y eliminar sus coriones tirando suavemente del corion además con unas pinzas. Los embriones pueden ser colocados en una solución al 5% PTU timbres en 22-24 horas después de la fecundación (HPF) para inhibir la formación de pigmento. Esto mejora la claridad de la imagen y es esencial para la realización de dos fotones axotomies de los axones sensoriales. Si el pigmento natural se permite a la forma, autofluorescencia oscurece los axones en el microscopio de dos fotones. Timbres solución para el pez cebra contiene 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, y 5 mM HEPES, pH 7,2.
3. Anestesiar a los embriones mediante la adición de ~ 0,02% tricaína a los timbres PTU. Hacer que los animales que no son sensibles al tacto antes de proceder.
4. Prepare la cámara de imagen a largo plazo mediante la aplicación de grasa de vacío a un lado de un anillo de vidrio o teflón y fijarlo en una hoja de cubierta de vidrio.
5. La transferencia de un embrión en los 42 grados solución de agarosa con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no transferir la mayor parte de los timbres PTU, a continuación, transferir el embrión con una gota de agarosa en una hoja de cubierta preparada.
6. La posición del embrión como se desee, como la agarosa se endurece. Tenga en cuenta que la cámara de imágenes se volcó cuando se hace para que la hoja de la cubierta será la superficie superior.
7. Si usted tiene una platina motorizada y puede localidades de varias imágenes a la vez, repita los pasos 1.4 a 1.6 por cada embrión.
8. Deje que la agarosa para solidificar completamente, y luego rellene el ring con tricaína 0,02% Timbres PTU.
9. Aplicar grasa de vacío al otro lado del anillo (s), y luego cubrir el anillo (s) con un portaobjetos de vidrio. Voltear la cámara sellada (s) otra vez. Estas cámaras se pueden utilizar para obtener imágenes en los microscopios vertical o invertida.

Parte 2: dos fotones usando un axotomía hecha a la medida de dos fotones con un microscopio Chameleon Ti-zafiro láser

1. Prepararse para la imagen. Lugar al embrión montado (s) en un portaobjetos bajo el microscopio. Se centran en un embrión con un objetivo 40X de agua (0,8 NA). Encienda el láser. Hemos sido capaces de visualizar de forma reproducible y daños GFP neuronas que expresan mediante los siguientes parámetros. Para visualizar los axones en una potencia no-perjudicial, establece láser a una longitud de onda de 910 nanómetros (nm) y una potencia de 30 milivatios (mW lista son la cantidad de energía en la muestra). Abra el software de imágenes. Usamos Software scanimage desarrollado en el laboratorio Karel Svoboda es ^{2, 3.}
2. Prensa enfoque para analizar el embrión con el láser de dos fotones, localizar el axón desea axotomize, y la captura de una imagen de este axón. Marque las posiciones Z primero y el último, adquirir la imagen, y hacer una proyección máxima de las pilas Z.
3. Zoom 70X en la rama del axón desea axotomize y detener la exploración. Aumentar la mW en la muestra del poder dañino de 180 mW, y realizar un análisis simple con el láser. Hacemos esto mediante el establecimiento de la cantidad de cortes de Z a 1 y pulsando "Grab". Esto debería ser suficiente para romper el axón. Véase la discusión de los métodos para optimizar el procedimiento para su microscopio y el objetivo experimental.
4. Reducir, reducir el poder de 30 mW y tomar una imagen.

Parte 3: dos fotones axotomía en 510 microscopio confocal Zeiss / dos fotones

1. Lugar montado embrión en el escenario y lo pongo en enfocar con el objetivo 25X de agua o un objetivo adecuado.
2. A su vez en el de dos fotones (910 nm) y argón (488 nm) en un entorno multi-pista, así que es posible pasar de uno a otro. Aunque los dos rayos láser se utilizan para detectar las buenas prácticas agrarias, la emisión de dos fotones se visualiza con el rojo, y la emisión de láser de argón con el verde para diferenciar los dos.
3. El uso del láser de argón para identificar un axón que se lastimen. En la configuración Z marca las secciones ópticas primera y la última. Toma una imagen confocal y crear una proyección máxima de la pila Z.
4. Elija la región del axón que se lesiona y traer a esta región en foco. Apague el láser de argón y encender el láser de dos fotones. Busque en la muestra con el de dos fotones en un láser de intensidad de la transmisión ~ 9% para asegurarse de que el axón se encuentra todavía en el foco.
5. Haga clic en el botón "stop" para que la herramienta de recorte estará disponible. El uso de cultivos para ampliar el área de interés. Por lo general, nos acercamos a ~ 70X (zoom se puede comprobar en el "modo" ficha). En virtud de los "canales" pestaña cambiar la intensidad de los dos fotones de la transmisión ~ 9% a la transmisión de un 15-20%.
6. Para cortar un axón activar el "XY rápida" botón durante 1 segundo y luego presione el botón de parada para evitar daños en exceso. El axón debe ser visto como escombros esparcidos si el procedimiento funciona.
7. Para asegurarse de que el axónfue dañado volver a los 488 nm láser de argón, tome otra imagen confocal, y crear una proyección máxima.

Parte 4: Confocal lapso de tiempo de imágenes en Zeiss LSM 510

1. Prepararse para la imagen. Si está utilizando una etapa de calefacción, asegúrese de que a su vez en al menos 30 minutos antes de la creación de su tiempo de intervalo. Lugar al embrión montado (s) en un portaobjetos bajo el microscopio. Se centran en un embrión con el objetivo de aire deseado. Utilizamos un 20X, 0,5 NA objetivo. Abrir Zeiss LSM 510 imágenes de software. Encienda el láser adecuado y establecer la configuración deseada. A continuación se describe un protocolo detallado para la imagen a largo plazo con el software Zeiss LSM Tiempo Multi. Estos métodos pueden ser adaptados para su uso en su propio microscopio con su software de imagen.
2. Definir la posición y la configuración de su primer embrión en la ventana de tiempo múltiples. Abra la exploración, el escenario, y las ventanas de varios tiempos. Activar exploración rápida en la ventana de análisis. Mover el escenario para la posición XY deseado. Marque las posiciones Z primero y el último en la ventana de análisis. Oprima Parar, luego media, también en la ventana de análisis. Espere a que la exploración de la parte media Z hasta el final, a continuación, pulse posición de la marca en la ventana de escenario. Si usted es sólo un embrión de imagen, haga clic en el "Lugar Único" pestaña en la ventana de tiempo múltiples. Haga clic en "Reemplazar XYZ" y luego en "Guardar configuración". Acuerdo cuando se le pregunta si desea sobrescribir la configuración anterior. Continúe con el paso 4.4. Si usted tiene una fase de mecanizado, se puede configurar múltiples lugares a los embriones de varias imágenes. En este caso, debe seleccionar la opción "varias ubicaciones" ficha antes de definir el XYZ y la configuración para la primera ubicación. Además, asegúrese de que el menú desplegable justo debajo del "varias ubicaciones" ficha está en la posición 1, y que el menú desplegable en la sección de configuración de múltiples dice loc 1, antes de hacer clic en Guardar configuración.
3. Definir la posición y la configuración del resto de los embriones en la ventana de tiempo múltiples. Busque su embrión siguiente, a continuación, pulse análisis rápido, mover el escenario en la posición deseada XY y Z marca las posiciones primera y la última en la ventana de análisis. Oprima Parar, luego media, también en la ventana de análisis. Espere a que la exploración de la parte media Z hasta el final, a continuación, pulse posición de la marca en la ventana de escenario. Haga clic en "Reemplazar XYZ". Compruebe que el menú desplegable justo debajo del "varias ubicaciones" ficha está en el punto 2, y que el menú desplegable en la sección de configuración de múltiples dice loc 2, a continuación, haga clic en "Guardar configuración". Acuerdo cuando se le pregunta si desea sobrescribir la configuración anterior. Repita este proceso para los embriones sobrantes.
4. Establecer los parámetros para la adquisición de la imagen en la ventana de Loc Multi. Elija la opción GR-GL en la "Lista de los bloques" sección, a continuación, introduzca el número deseado de repeticiones grupo. Este es el número de veces que el confocal se obtiene una imagen en cada lugar. Introduzca el intervalo de espera deseado en la sección Parámetros. Esta es la cantidad de tiempo desde el inicio de la repetición de imágenes una al inicio de la siguiente repetición. Seleccione "ZStackXY" en la sección de configuración. Introduzca su nombre de archivo base, en la sección inferior. Haga clic en "DB Seleccionar Imagen" y seleccione su mdb. Haga clic en el botón "Opciones". Seleccione la carpeta mdb para salvar los archivos temporales. Marque "mantener la imagen final abierto", "guardar la imagen final", y "en medio de la pila de z". Seleccione Intervalo de espera. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana de opciones. Haga clic en "hora de inicio". Dejar la ventana abierta a la hora Multi duración de la imagen.
5. Analizar los datos. Cuando el time-lapse ha terminado, el software Time Multi compila todos los archivos temporales en un archivo de resumen para cada ubicación. Si desea detener la película antes de que finalice, asegúrese de pulsar en "Finalizar" en lugar de "Stop", de modo que un archivo de resumen se creará. Los archivos temporales y archivos de resumen se guardarán automáticamente en la carpeta designada mdb. En el menú de software LSM, haga clic en "Vista 3D", luego "Proyección". Con el archivo de resumen seleccionado en el menú desplegable, haga clic en "Aceptar". Esto va a generar proyecciones de máxima de la pila de Z para cada imagen confocal. En el menú de software LSM, haga clic en "Archivo", luego "Exportar". Guardar las proyecciones de máxima como una serie de archivos tif. A continuación, puede crear una película de la serie de archivos tif utilizando ImageJ o QuickTime Pro.. Los axones de las imágenes LSM se puede rastrear en tres dimensiones utilizando el software de análisis de imagen (por ejemplo, Neurolucida de MicroBrightfield) para generar información cuantitativa detallada sobre la morfología del axón.

Parte 5: Los resultados representativos

Una experiencia exitosa se traducirá en una representación exacta de la dinámica celulars de la recuperación de una lesión axonal. Los embriones serán sanos después de la filmación, sin degeneración visible y latidos fuertes del corazón. La axotomía debería producir daños precisos, sólo cortar la rama definida del axón. No debe haber ningún daño a los axones los alrededores y la muerte celular mínima. Creemos que ver la muerte de una sola célula epidérmica directamente sobre el sitio de axotomía en ~ 50% de los experimentos. Si se observa más daño, debe optimizar sus dos fotones protocolo como se describe en la discusión.

Discussion

Hemos utilizado los métodos descritos a axotomize precisamente periférico los axones sensoriales y de observar directamente la regeneración en el embrión de pez cebra de vida. A largo plazo de lapso de tiempo de imagen confocal en el pez cebra puede ser utilizado para observar muchos procesos de desarrollo en vivo. El procedimiento de axotomía de dos fotones descritos podrán ser modificados para muchos de los objetivos experimentales. Hemos utilizado el mismo procedimiento general para la ablación de los órganos sensoriales del trigémino toda celulares de las neuronas, haciendo un acercamiento en el cuerpo de la célula en lugar de en una rama del axón periférico. Cualquier tipo de célula de identificación con fluorescencia puede ser precisamente dañado o ablación con el poder concentrado de los láser de femtosegundo. Nos inspiramos para perfeccionar estas técnicas para el sistema del pez cebra en estudios anteriores en otros sistemas donde los láseres pulsados ​​se utilizaron para crear daño localizado o para la ablación de las células ^4,5,6. En experimentos de control que confirmó que axotomía es muy preciso: nunca hemos dañado los axones cercanos, incluso cuando son las ramas de la misma celda, y sólo de vez en cuando las células epiteliales dañadas en estrecha yuxtaposición a los axones. Esta especificidad puede ser explicada por el hecho de que la intensidad de dos fotones de excitación láser disminuye cuadráticamente con la distancia desde el punto focal ^3,7. Por otra parte, ya que la energía emitida por el fluoróforo emocionado contribuye al daño solar, alrededor de las células sin etiqueta es probable que se salvaron.

La potencia del láser para dañar a un axón puede variar dependiendo de la configuración del láser, la profundidad de los tejidos, y su objetivo experimental. Si desea más daño axones en el embrión, más energía será requerida. Lo mejor es el intento de la axotomía en un bajo consumo de energía, y luego gradualmente aumentar la potencia hasta que encuentre la cantidad que cortar el axón. Una vez que haya determinado la cantidad adecuada de potencia láser para axotomía, debe ser capaz de utilizar de forma reproducible esta potencia del láser para causar daño tisular local. Si usted nota que el poder durante más tiempo se requiere para crear una axotomía, el láser y un microscopio puede requerir el mantenimiento (por ejemplo, el láser puede estar fuera de alineación). Asegúrese de que el láser es alineado correctamente, limpiar su objetivo, y comprobar los espejos.