Summary
موقع الطفرات الموجهة من البلازميدات كله هو وسيلة بسيطة لخلق أشكال مختلفة قليلا من البلازميد الأصلي. هنا علينا أن نظهر وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتقديم بدائل في قاعدة البلازميد قياسي باستخدام الكواشف.
Abstract
موقع الطفرات الموجهة من البلازميدات كله هو وسيلة بسيطة لخلق أشكال مختلفة قليلا من البلازميد الأصلي. مع هذا الأسلوب يمكن أن تتغير الجينات المستنسخة المستهدفة من قبل الحذف ، أو استبدال لقواعد الإدراج قليلة مباشرة في البلازميد. وهو يعمل عن طريق تضخيم ببساطة البلازميد كله ، في رد فعل غير thermocycling PCR مقرا لها. خلال رد فعل تتكامل الاشعال مطفرة ، تحمل الطفرة المرجوة ، في البلازميد توليفها حديثا. في هذا الفيديو التعليمي نظهر وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتقديم بدائل في قاعدة البلازميد. بروتوكول يعمل مع الكواشف القياسية ومستقلة عن مجموعات التجارية ، التي غالبا ما تكون مكلفة للغاية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول الحد من التكلفة الإجمالية للتفاعل إلى الثامنة وما يكلف به بعض مجموعات تجارية. نحن في هذا الفيديو التعليق أيضا على الخطوات الحاسمة خلال العملية ، ويعطي تعليمات مفصلة حول كيفية تصميم الاشعال مطفرة.
Protocol
مبدأ الطريقة :
توجه موقع الطفرات من البلازميدات كله وأوضح في هذا الفيديو هو أسلوب الطفرات التي تسمح لك لتغيير الجينات المستنسخة المستهدفة من قبل الحذف ، أو استبدال لقواعد الإدراج قليلة مباشرة في البلازميد. وهو يعمل عن طريق تضخيم البلازميد كله ، في رد فعل غير thermocycling PCR مقرا لها. خلال رد فعل تتكامل الاشعال مطفرة ، تحمل الطفرة المرجوة في شكل من أشكال عدم التطابق في البلازميد الأصلي ، وتوليفها في البلازميد حديثا. بعد إزالة البلازميد الأصلي من رد الفعل يحصل تحول البلازميد تحولت الى E. القولونية. الخطوات التالية هي لأغراض الفحص فقط ، لأن الكفاءة تحور هذه الطريقة ليست 100 ٪. الإجراء كلها تستغرق ثلاثة أيام ، ولكن يمكن القيام به في الجزء الرئيسي خلال يوم واحد.
1.0 يوم واحد :
1.1 رد فعل Thermocycling :
البلازميد الأصلي : هذا الموقع تطفير موجه بروتوكول يعمل بشكل أفضل مع البلازميدات تصل إلى 10KB. البلازميدات هي أكبر من الصعب بعض الشيء لتتحول مع هذا الأسلوب ، وربما يستغرق بعض الصبر والتكيف للظروف thermocycling و / أو الخلايا المختصة. وعلاوة على ذلك يجب أن تكون معزولة البلازميد التي كنت تعمل مع من سد + البكتيريا سلالة. للتفاعل thermocycling ستحتاج 10-60 NGS من البلازميد تريد يتحور.
الاشعال : قبل أن تتمكن من إعداد رد فعلك thermocycling يكون لديك الاشعال في متناول يديك. كنت بحاجة لحوالي 150 نانوغرام في كل التمهيدي مطفرة. فلا بأس إذا كنت تأخذ 1.5 ميكرولتر من 1:10 مساء الأسهم المخفف 100. هناك بعض الإرشادات البسيطة التي يجب أخذها في الاعتبار عند تصميم الاشعال الخاص مطفرة :
- ينبغي أن يكون الاشعال مكملة لبعضها البعض
- ينبغي أن يكون الاشعال بين 25 و 45 النيوكليوتيدات في الطول
- يجب أن يرد في شكل طفرات لعدم التطابق في البلازميد الأصلي في كل من المشارع
- وينبغي أن تركز على عدم التطابق في التمهيدي ويحيط بها ما لا يقل عن 8 النيوكليوتيدات على كل جانب
- ينبغي أن يكون لها الاشعال GC - مضمون لا يقل عن 40 ٪
- ينبغي أن نهاية الاشعال ورئيس الوزراء 5 3 مع واحد أو أكثر أو سيزيوم GS
- والاشعال لا تحتاج إلى أن يكون فسفرته ، ولا يجب عليهم أن يكونوا FPLC أو المنقى PAGE ، المحلاة مجرد أنها يجب أن تكون.
- لحساب تيم كنت لا تحتاج إلى أي صيغة لكن تيم على شهادة الشحن ينبغي أن يكون أعلى من 60 درجة مئوية.
- لأغراض الفحص هو عملية لإدراج أو حذف موقع قيود مع الطفرة الخاص. بسبب تدهور الشفرة الوراثية هناك الكثير من الاحتمالات لإدراج موقع قيود مع الطفرة التي تريدها. الموقع الإلكتروني للBiolabs نيو انغلاند يوفر أداة للعثور على مثل هذا التقييد موقع المناسب. ببساطة إدخال التسلسل الخاص التمهيدي الترميز لتسلسل الأحماض الأمينية التي تريدها ، وذلك باستخدام رمز الغموض عن الحمض النووي. ستقوم الأداة مكتشف انزيم اقول لكم يمكن عرض مواقع موازية لتقييد الطفرة التي تريدها. إذا لم تتمكن من العثور على أي موقع قيد ممكن أو غير عملي بهذه الطريقة ، قد إدراج أي موقع دون قيود جديدة تتعلق الشفرة الوراثية في موقع الطفرة. بعد ذلك يمكنك استخدام هذا البلازميد كقالب لسلسلة من الطفرات التي سيتم حذف هذا القيد من خلال موقع الإدراج الاشعال ومطفرة الجديدة. هذا النهج قد تكون مريحة جدا إذا كنت تخطط للقيام بسلسلة من الطفرات في نفس الموقع من البلازميد.
الحمض النووي البلمرة : للحصول على هذه الطريقة تحتاج إلى بالحرارة الحمض النووي البلمرة التي يسلك نشاط 3' - 5 'نوكلياز خارجية ويخلق ينتهي حادة. نستخدم دائما المؤتلف Pfu - البلمرة من Fermentas. إذا كنت قد حصلت مشاكل مع الخطوات التضخيم قد حاول بوليميريز العالي الجودة ، ولكن بالنسبة لمعظم أغراض Pfu القياسية سوف يكون كافيا. إكمال التفاعل مع العازلة dNTPs بوليميريز ، والمياه.
1.2 الشروط Thermocycling
يجب تعيين ما يصل thermocycler بالطريقة التالية. تم تعيين تمسخ المرحلة الأولية والمتكررة ل30sec في 95 درجة مئوية.
لا يجب أن درجة الحرارة الصلب من الاشعال تحسب مع الصيغ المعقدة. وضعناها في درجة الحرارة عادة الصلب إلى 55 درجة مئوية والصلب الوقت لدقيقة واحدة. لالاشعال من 25 إلى 30 النيوكليوتيدات التي سوف تستخدم في الغالب ، وهذا يعمل لدينا 95 ٪ من الوقت. على أية حال إذا كان هذا لا ينبغي أن يعمل ، حاول ببساطة بدرجات الحرارة الصلب بين 50 -- و 60 درجة مئوية.
درجة الحرارة يعتمد على استطالة بوليميريز تستخدمها. في هذه التظاهرة التي قمنا استخدام Pfu - البلمرة من Fermentas ، الذي يدعو إلى استطالة درجة الحرارة من 72 درجة مئوية. الوقت استطالة تتغير وفقا لحجم البلازميد. نحسب دائما 1 دقيقة لكل كيلوبايت ، وإضافة المزيد من دقيقة واحدة لذلكالوقت. على سبيل المثال ، لبلازميد 9kb سوف نختار 10min كوقت استطالة.
18 دورات كافية لخلق ما يكفي من تحور البلازميد لاستخدامها مرة أخرى. الحفاظ على عدد من الدورات منخفضة ، ويوفر لك الوقت أيضا.
1.3 Gelcheck بعد رد فعل Thermocycling
وينبغي التحقق من التضخيم ناجحة عن طريق إجراء الكهربائي. مباشرة بعد الانتهاء من ركوب الدراجات ، تحميل 5 ميكرولتر من رد الفعل على هلام 1 ٪ agarose تاي. إذا كان التضخيم كان ناجحا ، يجب أن نرى الفرقة متميزة. لكن إذا كان الحمض النووي توليف حديثا غير مرئية بشكل واضح على هلام ، قد حاولت أن يعجل رد الفعل كله واستخدامه للتحول في الخطوة التالية. بالنسبة لنا هذا نادرا ما عملت ولكن الأمر يستحق المحاولة لإعطاء. أفضل شيء نفعله إذا فعل هو لا يعمل لضبط درجة الحرارة الصلب.
1.4 DpnI الهضم :
يجب أن يكون قبل التحول إزالة البلازميد الأصلي الذي كان بمثابة قالب من رد الفعل على منع خلفية قوية. يتم ذلك عن طريق تقييد مع DpnI الهضم. هذا التقييد تخفيضات ميثليته نوكلياز داخلية فقط البلازميد. الاعتراف به والتقييد هو موقع GATC تسلسل بينما يجب أن يكون ميثليته. عندما هضم DpnI فقط مع البلازميد الأصلي unmutated التي كانت معزولة من سد + يحصل على خفض التوتر ، لا يتأثر البلازميد تصنيعه حديثا تحور التي لا ميثليته بواسطة DpnI. ببساطة إضافة 1-2 ميكرولتر من DpnI للتفاعل واحتضان ما لا يقل عن ساعة واحدة عند 37 درجة. ويمكن عند استخدام سريع الهضم DpnI يمكن تقليل فترة حضانة حوالي 15 دقيقة. نوعية DpnI الخاص وفترة حضانة هذا التقييد الهضم يحدد إلى حد كبير مدى قوة خلفيتك مع البلازميد unmutated سيكون.
1.5 التحول :
وبعد الهضم DpnI البلازميد مستعدة للتحول إلى E. المختصة القولونية الخلايا. ببساطة إضافة 5 ميكرولتر من ردود فعل الهضم DpnI في الخلايا المختصة وتنفيذ التحول على النحو الموصى به في المختبر الخاص بك. في حالتنا نحن نستخدم الإجراء الصدمة الحرارية التي يحتضنها خليط من البكتيريا البلازميد على الجليد لمدة 30 دقيقة ومن ثم الصدمة الحرارية فيه في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. بعد إضافة 200 ميكرولتر SOC - الحل ، والمحتضنة للبكتيريا ، ويهز بقوة ، عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة 1 بعد 1 ساعة ومطلي البكتيريا على اختيار وسائل الإعلام آغار.
2.0 اليوم الثاني
2.1 فحص جزء من الحيوانات المستنسخة 1 : اختيار من الحيوانات المستنسخة
لأن الكفاءة الطفرة ليست 100 ٪ تحتاج إلى الشاشة لالمسوخ الخاص. ونحن نفعل ذلك من خلال تقييد الهضم التي نعمل من أجل التحقق من وجود أو عدم وجود قيود على الموقع الذي نحن إضافتها أو حذفها من خلال التكامل التمهيدي. لهذا الغرض نختار عادة بزيادة ثمانية وتنمو مستعمرات لهم طوال الليل لإعداد البلازميد في اليوم التالي.
اليوم الثالث 3.0
3.1 فحص جزء من الحيوانات المستنسخة 2 : تقييد مع انزيم الهضم علامة
في اليوم الثالث قمت بإجراء الإعدادية البسيطة واللاحقة مع انزيم الهضم تقييد العلامة الخاصة بك. على هلام ترون ثم أي واحد من الحيوانات المستنسخة الخاص تحمل الطفرة المرجوة وتلك التي لا.
أسلوب الفحص باستخدام الهضم تقييد يعمل بشكل جيد جدا. ومع ذلك ، يجب تأكيد الطفرة الخاص الناجحة التي قام بها التسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
موقع الطفرات الموجهة هي أسلوب الطفرات ، التي توفر طريقة سريعة لتحور الجين يحملها البلازميد. ويمكن أن يتم رد الفعل كله في يوم واحد فقط. مع هذا الأسلوب ، فإنه سيكون في حاجة فقط زوج من الاشعال مجانية تحمل طفرات المطلوب وتصحيح التجارب المطبعية بوليميريز مثل Pfu - البلمرة. ويمكن فصل بلازميد تصنيعه حديثا من البلازميد الأبوية هضم التفاعل مع تقييد DpnI الانزيم. هذا الانزيم يساعد على هضم الحمض النووي ميثليته فقط. ولذلك لا يمكن إلا أن حولت البلازميد توليفها حديثا. في هذا البرنامج التعليمي أظهرنا أداء الطفرات الموجهة موقع باستخدام الطفرات عدة محلية الصنع. الاستفادة من هذه المجموعة هو توفير التكاليف في حين تظل فعالية. النقاط الحاسمة لهذه الطريقة هي التصميم التمهيدي ودرجة الحرارة الصلب. في حالة يمكن أن الحمض النووي مركبة جديدة لا يمكن تصور بعد الكهربائي ، الأمر الذي قد يدل على فشل الأسلوب ، يمكن للمرء أن يحاول لترسيب ردود الفعل كلها واستخدامه لتحقيق التحول في البكتيريا. إلا أن أفضل طريقة لحل هذه المشكلة هو محاولة لتحسين درجة الحرارة الصلب أو زيادة طول المنطقة مستمرة في الاشعال. كذلك ، قد تستخدم البلمرة جودة عالية أو انزيم التقييد أيضا إلى تحسين حساسية من رد فعل. الخلايا المختصة تعتبر أيضا من العوامل الرئيسية التي الآثار successfulness من هذا الأسلوب. لذا المتوسطة (107 CFU DNA / ميكروغرام) أو عالية (109 CFU DNA / ميكروغرام) الخلايا المختصة هي الأفضل.
في هذا البرنامج التعليمي على الرغم من أننا لم تثبت الحذف أو الإدراج باستخدام عدة محلية الصنع ، وقد نجحنا في القيام بهذه المختبرات لدينا. كنا قادرين على استبدال بنجاح ، إدراج أو حذف ما لا يقل عن 3 قواعد في نفس الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pfu polymerase (recombinant or native) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| dNTP mix 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI or DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| primers | Invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
